Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires

Summary

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour imager les forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires. Cette approche permet de cartographier les forces du récepteur >4,7pN en temps réel et d’intégrer les forces au fil du temps.

Abstract

Les forces mécaniques transmises à la jonction entre deux cellules voisines et à la jonction entre les cellules et la matrice extracellulaire sont essentielles pour réguler de nombreux processus allant du développement à l’immunologie. Par conséquent, le développement des outils pour étudier ces forces à l’échelle moléculaire est essentiel. Notre groupe a développé une suite de capteurs de tension moléculaire pour quantifier et visualiser les forces générées par les cellules et transmises à des ligands spécifiques. La classe la plus sensible des capteurs de tension moléculaire est composée d’épingles à cheveux à boucle tige d’acide nucléique. Ces capteurs utilisent des paires fluorophore-quencher pour rendre compte de l’extension mécanique et du dépliage des épingles à cheveux ADN sous force. L’un des défis des capteurs de tension en épingle à cheveux à ADN est qu’ils sont réversibles avec un repliement rapide en épingle à cheveux à la fin de la tension et que les forces transitoires sont donc difficiles à enregistrer. Dans cet article, nous décrivons les protocoles de préparation des capteurs de tension de l’ADN qui peuvent être « verrouillés » et empêchés de se replier pour permettre le « stockage » des informations mécaniques. Cela permet d’enregistrer des forces de piconewton hautement transitoires, qui peuvent ensuite être « effacées » par l’ajout d’acides nucléiques complémentaires qui suppriment le verrou. Cette capacité à basculer entre la cartographie de tension en temps réel et le stockage d’informations mécaniques révèle des forces faibles, de courte durée et moins abondantes, qui sont couramment utilisées par les cellules T dans le cadre de leurs fonctions immunitaires.

Introduction

Les cellules immunitaires se défendent contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses en rampant et en balayant continuellement les surfaces des cellules cibles à la recherche d’antigènes, en cloutant leur surface ^1,2. La reconnaissance de l’antigène est initiée lors de la liaison entre le récepteur des lymphocytes T (TCR) et le complexe peptide-majeur d’histocompatibilité CMH (pMHC) exprimé à la surface des cellules cibles. Parce que la reconnaissance TCR-pMHC se produit à la jonction entre deux cellules mobiles, il a longtemps été soupçonné de subir des forces mécaniques. De plus, cela a conduit au modèle mécanocapteur d’activation TCR, qui suggère que les forces TCR contribuent à sa fonction ^3,4. Pour comprendre quand, où et comment les forces mécaniques contribuent au fonctionnement des lymphocytes T, il est impératif de développer des outils pour visualiser les forces moléculaires transmises par les lymphocytes T. Traditionnellement, des méthodes telles que la microscopie à force de traction (TFM) et les réseaux de micropiliers sont utilisés pour étudier les forces cellulaires ^5,6. Cependant, la sensibilité aux forces de la TFM et des réseaux de micropiliers est à l’échelle du nanonewton (nN) et est donc souvent insuffisante pour étudier les forces moléculaires du piconewton (pN) transmises par les récepteurs cellulaires⁷. Pour améliorer la force et la résolution spatiale de la détection, notre laboratoire a été le pionnier du développement de sondes de tension moléculaire, qui ont été initialement synthétisées à l’aide de polymères de polyéthylèneglycol (PEG)⁷. Les sondes de tension moléculaire sont composées d’un « ressort » moléculaire extensible (PEG, protéine, ADN) flanqué d’un fluorophore et d’un quencher et sont ancrées sur une surface. Les forces appliquées à l’extrémité de la sonde conduisent à son extension, séparant le fluorophore et l’anti-quenceur, et générant ainsi un fort signal de fluorescence (Figure 1A)^8,9,10.

Au cours de la dernière décennie, nous avons développé une bibliothèque de différentes classes de sondes de tension moléculaire avec des éléments à ressort fabriqués à partir d’acides nucléiques¹¹, de protéines¹⁰ et de polymères⁸. Parmi celles-ci, les sondes de tension basées sur l’ADN fournissent le rapport signal sur bruit le plus élevé et la plus grande sensibilité à la force, qui est facilement réglée de quelques pN à ~20 pN¹¹. Nous avons utilisé ces sondes de tension d’ADN en temps réel pour étudier les forces moléculaires générées par de nombreux types de cellules, y compris les fibroblastes, les cellules cancéreuses, les plaquettes et les cellules immunitaires^11,12,13. Ce manuscrit décrira des protocoles pour synthétiser et assembler des sondes de tension d’ADN sur une surface afin de cartographier les forces des récepteurs moléculaires avec une résolution de force pN à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel. Bien que la procédure actuelle comprenne des modifications chimiques de l’acide nucléique pour introduire le rapporteur fluorescent (figure 1B), il est important de noter que de nombreuses étapes de modification et de purification peuvent être sous-traitées à des entreprises de synthèse d’ADN personnalisées. Par conséquent, la technologie des sondes de tension de l’ADN est facile et accessible aux communautés plus larges de la biologie cellulaire et de la mécanobiologie.

Brièvement, pour assembler des capteurs de tension d’ADN, une épingle à cheveux à ADN est hybridée à un brin de ligand fluorescent sur un bras et à un brin d’ancrage de quencher sur l’autre bras, puis immobilisée sur un substrat de verre (Figure 1C, tension en temps réel). En l’absence de force mécanique, l’épingle à cheveux est fermée et la fluorescence est donc éteinte. Cependant, lorsque la force mécanique appliquée est supérieure à la F_1/2 (la force à l’équilibre qui conduit à une probabilité de 50% de se déplier), l’épingle à cheveux fond mécaniquement et un signal fluorescent est généré.

En nous appuyant sur le capteur de tension de l’ADN en temps réel, nous décrivons également des protocoles pour cartographier les forces accumulées, ce qui est particulièrement utile pour étudier les interactions entre les récepteurs des cellules immunitaires et leur ligand naturel. En effet, les récepteurs immunitaires présentent souvent des liaisons de courte durée ^3,14. Les forces accumulées sont imagées à l’aide d’un brin de « verrouillage » qui se lie préférentiellement aux épingles à cheveux d’ADN ouvertes et permet le stockage des signaux de fluorescence associés aux événements de traction mécanique (Figure 1C, tension verrouillée). Le brin de verrouillage est conçu pour lier un site de liaison cryptique qui est exposé lors de la fusion induite mécaniquement de l’épingle à cheveux et verrouiller l’épingle à cheveux à l’état ouvert en bloquant le repliement de l’épingle à cheveux, stockant ainsi le signal de tension et générant une carte de tension accumulée. De plus, le brin de verrouillage est conçu avec un toehold à huit nucléotides, ce qui permet une réaction de déplacement du brin médiée par le teil avec son complément complet, le brin de « déverrouillage ». Avec l’ajout du brin de déverrouillage, le brin de verrouillage lié est retiré de la construction en épingle à cheveux, effaçant le signal de tension stocké et réinitialisant l’épingle à cheveux à l’état temps réel.

Figure 1 : Schéma des sondes de tension moléculaire de pointe. (A) Conception générale de sonde de tension moléculaire en temps réel, (B) Brins pour la construction de sonde de tension basée sur l’ADN, et (C) sondes de tension basées sur l’ADN et leur basculement entre l’état en temps réel et l’état verrouillé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le protocole principal comprend quatre sections principales: préparation des oligonucléotides, préparation de surface, imagerie et analyse des données. Ce protocole a été démontré avec succès par notre laboratoire et d’autres dans des lymphocytes T CD8+ OT-1 naïfs et activés, des cellules CD4⁺ OT-II, ainsi que des hybridomes, et peut être appliqué pour interroger différents récepteurs de cellules immunitaires, y compris le récepteur des cellules T, le récepteur de mort cellulaire programmée (PD1) et les forces de l’antigène 1 associé à la fonction lymphocytaire (LFA-1). Les lymphocytes T naïfs de CD8⁺ OT-1 sont utilisés comme exemple de lignée cellulaire dans cet article.

Protocol

Les souris transgéniques OT-1 sont hébergées à la Division of Animal Resources Facility de l’Université Emory. Toutes les expériences ont été approuvées et réalisées selon le protocole du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC). 1. Préparation d’oligonucléotides Dissoudre l’ADN du brin de ligand dans l’eau (résistivité de 18,2 MΩ, utilisée tout au long du protocole). Vortex et faire tourner la solution avec une centrifugeuse de t…

Representative Results

Nous montrons ici des images représentatives du contrôle de la qualité de surface (Figure 4). Une surface de haute qualité doit avoir un fond propre dans le canal RICM (Figure 4B) et une intensité de fluorescence uniforme dans le canal Cy3B (Figure 4C). Avec le même équipement d’imagerie et des conditions d’acquisition d’imagerie par fluorescence identiques, l’intensité de fluorescence de fond doit être constante et…

Discussion

Avec les procédures détaillées fournies ici, on peut préparer des substrats de sonde de tension en épingle à cheveux ADN pour cartographier et quantifier la tension du récepteur produite par les cellules immunitaires. Lorsque les cellules sont plaquées sur le substrat de la sonde de tension en épingle à cheveux de l’ADN, elles atterrissent, se fixent et se propagent lorsque les récepteurs détectent les ligands à la fois chimiquement et mécaniquement, ce dernier étant détecté par nos sondes. Cependant, …

Materials

3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal