DNA-spenningssonder for å kartlegge immuncellers forbigående piconeton-reseptorkrefter

Summary

Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for bruk av DNA-baserte spenningsprober for å avbilde reseptorkreftene som påføres av immunceller. Denne tilnærmingen kan kartlegge reseptorkrefter >4.7pN i sanntid og kan integrere krefter over tid.

Abstract

Mekaniske krefter overført ved krysset mellom to naboceller og ved krysset mellom celler og den ekstracellulære matrisen er kritiske for å regulere mange prosesser som spenner fra utvikling til immunologi. Derfor er det viktig å utvikle verktøyene for å studere disse kreftene på molekylær skala. Vår gruppe utviklet en pakke med molekylære spenningssensorer for å kvantifisere og visualisere kreftene som genereres av celler og overføres til bestemte ligander. Den mest følsomme klassen av molekylære spenningssensorer består av nukleinsyrestamsløyfehårnåler. Disse sensorene bruker fluorofor-slukkerpar for å rapportere om mekanisk forlengelse og utfoldelse av DNA-hårnåler under kraft. En utfordring med DNA-hårnålsspenningssensorer er at de er reversible med rask hårnålsfolding ved avslutning av spenningen, og dermed er forbigående krefter vanskelige å registrere. I denne artikkelen beskriver vi protokollene for å forberede DNA-spenningssensorer som kan “låses” og forhindres i å brettes på nytt for å muliggjøre “lagring” av mekanisk informasjon. Dette muliggjør opptak av svært forbigående piconewton-krefter, som deretter kan “slettes” ved tilsetning av komplementære nukleinsyrer som fjerner låsen. Denne evnen til å veksle mellom sanntids spenningskartlegging og mekanisk informasjonslagring avslører svake, kortvarige og mindre rikelig krefter, som ofte brukes av T-celler som en del av deres immunfunksjoner.

Introduction

Immunceller forsvarer seg mot patogener og kreftceller ved kontinuerlig å krype og skanne overflatene til målceller for antigener, og pigge overflaten ^1,2. Antigengjenkjenning initieres ved binding mellom T-cellereseptoren (TCR) og peptid-major histokompatibilitetskomplekset MHC (pMHC) komplekset uttrykt på overflaten av målceller. Fordi TCR-pMHC-gjenkjenning skjer i krysset mellom to mobilceller, har det lenge vært mistanke om å oppleve mekaniske krefter. Videre førte dette til mekanosensormodellen for TCR-aktivering, noe som antyder at TCR-krefter bidrar til funksjonen ^3,4. For å forstå når, hvor og hvordan mekaniske krefter bidrar til T-cellefunksjon, er det viktig å utvikle verktøy for å visualisere molekylære krefter som overføres av T-celler. Tradisjonelt brukes metoder som trekkraftmikroskopi (TFM) og mikropillararrays for å undersøke cellulære krefter ^5,6. Imidlertid er kraftfølsomheten til TFM og mikropilarrayer på nanonewton (nN) -skalaen og er derfor ofte utilstrekkelig til å studere molekylære piconewton (pN) -krefter overført av cellereseptorer⁷. For å forbedre kraften og romlig oppløsning for deteksjon, var laboratoriet vårt banebrytende for utviklingen av molekylære spenningsprober, som opprinnelig ble syntetisert ved bruk av polyetylenglykol (PEG) polymerer⁷. Molekylære spenningsprober består av en utvidbar molekylær “fjær” (PEG, protein, DNA) flankert av en fluorofor og slukker og er forankret på en overflate. Krefter påført sondens endepunkt fører til dens forlengelse, separerer fluoroforen og slukkeren, og genererer dermed et sterkt fluorescenssignal (figur 1A) ^8,9,10.

I løpet av det siste tiåret har vi utviklet et bibliotek med forskjellige klasser av molekylære spenningsprober med fjærelementer laget av nukleinsyrer¹¹, proteiner¹⁰ og polymerer⁸. Blant disse gir de DNA-baserte spenningsprobene det høyeste signal-støyforholdet og den største kraftfølsomheten, som enkelt justeres fra noen få pN opp til ~20 pN¹¹. Vi har brukt disse sanntids DNA-spenningsprobene til å studere molekylære krefter generert av mange forskjellige celletyper, inkludert fibroblaster, kreftceller, blodplater og immunceller^11,12,13. Dette manuskriptet vil beskrive protokoller for å syntetisere og sette sammen DNA-spenningsprober på en overflate for å kartlegge molekylære reseptorkrefter med pN-kraftoppløsning ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Mens den nåværende prosedyren inkluderer kjemiske modifikasjoner av nukleinsyren for å introdusere fluorescerende reporter (figur 1B), er det viktig å merke seg at mange av modifikasjons- og rensetrinnene kan outsources til tilpassede DNA-syntesefirmaer. Derfor er DNA-spenningssondeteknologien lett og tilgjengelig for de bredere cellebiologi- og mekanobiologimiljøene.

Kort sagt, for å montere DNA-spenningssensorer, hybridiseres en DNA-hårnål til en fluorescerende ligandstreng på den ene armen og en slukkeankerstreng på den andre armen og immobiliseres deretter på et glasssubstrat (figur 1C, sanntidsspenning). I fravær av mekanisk kraft er hårnålen lukket, og dermed slokkes fluorescensen. Men når den påførte mekaniske kraften er større enn F_1/2 (kraften ved likevekt som fører til en 50% sannsynlighet for å utfolde seg), smelter hårnålen mekanisk, og et fluorescerende signal genereres.

Ved å bygge på sanntids DNA-spenningssensor beskriver vi også protokoller for å kartlegge akkumulerte krefter, noe som er spesielt nyttig for å studere interaksjoner mellom reseptorer på immunceller og deres naturlige ligand. Dette skyldes at immunreseptorer ofte viser kortvarige bindinger ^3,14. Akkumulerte krefter avbildes ved hjelp av en “låsende” streng som fortrinnsvis binder seg til åpne DNA-hårnåler og muliggjør lagring av fluorescenssignaler assosiert med mekaniske trekkhendelser (figur 1C, låst spenning). Låsestrengen er designet for å binde et kryptisk bindingssted som eksponeres ved mekanisk indusert smelting av hårnålen og låse hårnålen i åpen tilstand ved å blokkere hårnålsfolding, og dermed lagre spenningssignalet og generere et akkumulert spenningskart. Videre er låsestrengen designet med et åtte-nukleotidtåhold, som muliggjør en tåholdsmediert strengforskyvningsreaksjon med sitt fulle komplement, den “låsende” strengen. Med tillegg av opplåsingsstrengen fjernes den bundne låsestrengen av hårnålskonstruksjonen, sletter det lagrede spenningssignalet og tilbakestiller hårnålen tilbake til sanntidstilstanden.

Figur 1: Skjema for state-of-art molekylære spenningsprober. (A) Generell utforming av sanntids molekylær spenningssonde, (B) Tråder for DNA-basert spenningssondekonstruksjon, og (C) konstruerte DNA-baserte spenningsprober og deres veksling mellom sanntidstilstand og låst tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hovedprotokollen består av fire hovedseksjoner – oligonukleotidpreparasjon, overflatebehandling, avbildning og dataanalyse. Denne protokollen har blitt vellykket demonstrert av laboratoriet vårt og andre i naive og aktiverte OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 ⁺ -celler, samt hybridomer, og kan brukes til å forhøre forskjellige immuncellereseptorer, inkludert T-cellereseptor, programmert celledødsreseptor (PD1) og lymfocyttfunksjonsassosiert antigen 1 (LFA-1) krefter. OT-1 CD8⁺ naive T-celler brukes som eksempelcellelinje i denne artikkelen.

Protocol

OT-1 transgene mus er plassert på Division of Animal Resources Facility ved Emory University. Alle forsøkene ble godkjent og utført under protokollen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Oligonukleotid forberedelse Løs opp ligandstrengens DNA i vann (18,2 MΩ resistivitet, brukt gjennom hele protokollen). Vortex og spinn ned løsningen med en bordplate sentrifuge. Still inn vannvolumet slik at den endelige konsentrasjonen er 1 mM. Valider konsentrasjonen ved å…

Representative Results

Her viser vi representative bilder av overflatekvalitetskontroll (figur 4). En overflate av høy kvalitet bør ha en ren bakgrunn i RICM-kanalen (figur 4B) og jevn fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med samme bildebehandlingsutstyr og identiske fluorescensavbildningsoppkjøpsbetingelser, bør bakgrunnsfluorescensintensiteten være konsistent og reproduserbar hver gang når man utfører eksperimenter med DNA-prober. Vi …

Discussion

Med de detaljerte prosedyrene som er gitt her, kan man forberede DNA-hårnålsspenningssondesubstrater for å kartlegge og kvantifisere reseptorspenningen produsert av immunceller. Når celler blir belagt på DNA-hårnålsspenningssondesubstratet, lander, fester de seg og sprer seg når reseptorene sanser ligandene både kjemisk og mekanisk, hvorav sistnevnte oppdages av våre sonder. I noen tilfeller kan imidlertid celler mislykkes i å spre seg (Figur 7A) eller ikke produserer spenningssig…

Materials

3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal