Зонды натяжения ДНК для картирования переходных сил рецептора пиконьютона иммунными клетками

Summary

В этой статье описывается подробный протокол использования датчиков натяжения на основе ДНК для визуализации рецепторных сил, приложенных иммунными клетками. Этот подход может отображать рецепторные силы >4,7 пН в режиме реального времени и может интегрировать силы с течением времени.

Abstract

Механические силы, передаваемые на стыке между двумя соседними клетками и на стыке между клетками и внеклеточным матриксом, имеют решающее значение для регуляции многих процессов, начиная от развития и заканчивая иммунологией. Поэтому разработка инструментов для изучения этих сил на молекулярном уровне имеет решающее значение. Наша группа разработала набор датчиков молекулярного натяжения для количественной оценки и визуализации сил, генерируемых клетками и передаваемых конкретным лигандам. Наиболее чувствительный класс датчиков молекулярного натяжения состоит из шпилек со стволовыми петлями нуклеиновых кислот. Эти датчики используют пары флуорофор-гаситель, чтобы сообщать о механическом расширении и разворачивании шпилек ДНК под действием силы. Одна из проблем, связанных с датчиками натяжения шпилек ДНК, заключается в том, что они обратимы с быстрым складыванием шпильки после прекращения натяжения, и, таким образом, переходные силы трудно зарегистрировать. В этой статье мы описываем протоколы подготовки датчиков натяжения ДНК, которые можно «заблокировать» и предотвратить повторное складывание, чтобы обеспечить «хранение» механической информации. Это позволяет регистрировать высокопереходные пиконетонные силы, которые впоследствии могут быть «стерты» добавлением комплементарных нуклеиновых кислот, снимающих блокировку. Эта способность переключаться между картированием напряжения в реальном времени и механическим хранением информации выявляет слабые, кратковременные и менее обильные силы, которые обычно используются Т-клетками как часть их иммунных функций.

Introduction

Иммунные клетки защищаются от патогенов и раковых клеток, непрерывно ползая и сканируя поверхности клеток-мишеней на наличие антигенов, усеивая их поверхность ^1,2. Распознавание антигена инициируется при связывании между Т-клеточным рецептором (TCR) и комплексом пептидно-главной гистосовместимости MHC (pMHC), экспрессируемым на поверхности клеток-мишеней. Поскольку распознавание TCR-pMHC происходит на стыке между двумя подвижными клетками, долгое время подозревалось, что он испытывает механические силы. Более того, это привело к механосенсорной модели активации TCR, которая предполагает, что силы TCR способствуют его функции ^3,4. Чтобы понять, когда, где и как механические силы способствуют функционированию Т-клеток, необходимо разработать инструменты для визуализации молекулярных сил, передаваемых Т-клетками. Традиционно для исследования клеточных сил^5,6 используются такие методы^, как тракционно-силовая микроскопия (TFM) и микропиллярные матрицы. Однако силовая чувствительность TFM и микростолбовых матриц находится в масштабе наноньютона (nN) и, таким образом, часто недостаточна для изучения молекулярных пиконьютонных (pN) сил, передаваемых клеточными рецепторами⁷. Чтобы улучшить силу и пространственное разрешение для обнаружения, наша лаборатория впервые разработала зонды молекулярного натяжения, которые первоначально были синтезированы с использованием полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ)⁷. Зонды молекулярного натяжения состоят из выдвижной молекулярной «пружины» (ПЭГ, белок, ДНК), окруженной флуорофором и гасителем, и закреплены на поверхности. Силы, приложенные к концу зонда, приводят к его расширению, разделяя флуорофор и гаситель, и, таким образом, генерируя сильный сигнал флуоресценции (рис. 1А)^8,9,10.

За последнее десятилетие мы разработали библиотеку различных классов зондов молекулярного натяжения с пружинными элементами, изготовленными из нуклеиновых кислот¹¹, белков¹⁰ и полимеров⁸. Среди них датчики натяжения на основе ДНК обеспечивают самое высокое соотношение сигнал/шум и наибольшую чувствительность к силе, которая легко настраивается от нескольких пН до ~20 пН¹¹. Мы использовали эти зонды натяжения ДНК в реальном времени для изучения молекулярных сил, генерируемых многими различными типами клеток, включая фибробласты, раковые клетки, тромбоциты и иммунные клетки^11,12,13. В этой рукописи будут описаны протоколы синтеза и сборки зондов натяжения ДНК на поверхности для картирования молекулярных рецепторных сил с разрешением силы pN с использованием обычного флуоресцентного микроскопа. В то время как текущая процедура включает химические модификации нуклеиновой кислоты для введения флуоресцентного репортера (рис. 1B), важно отметить, что многие этапы модификации и очистки могут быть переданы на аутсорсинг компаниям, занимающимся синтезом ДНК. Таким образом, технология зондов натяжения ДНК проста и доступна для более широких сообществ клеточной биологии и механобиологии.

Вкратце, для сборки датчиков натяжения ДНК шпилька ДНК гибридизуется с флуоресцентной цепью лиганда на одном плече и якорной нитью гасителя на другом плече, а затем иммобилизуется на стеклянной подложке (рис. 1C, натяжение в реальном времени). При отсутствии механической силы шпилька закрывается, и таким образом флуоресценция гасится. Однако, когда приложенная механическая сила больше, чем F_1/2 (сила в равновесии, которая приводит к 50% вероятности разворачивания), шпилька механически плавится, и генерируется флуоресцентный сигнал.

Основываясь на датчике натяжения ДНК в реальном времени, мы также описываем протоколы для отображения накопленных сил, что особенно полезно для изучения взаимодействия между рецепторами на иммунных клетках и их естественным лигандом. Это связано с тем, что иммунные рецепторы часто демонстрируют короткоживущие связи ^3,14. Накопленные силы визуализируются с помощью «запирающей» цепи, которая преимущественно связывается с открытыми шпильками ДНК и позволяет хранить флуоресцентные сигналы, связанные с механическими событиями вытягивания (рис. 1C, заблокированное натяжение). Фиксирующая прядь предназначена для связывания загадочного места связывания, который подвергается воздействию при механически индуцированном плавлении шпильки, и блокировки шпильки в открытом состоянии путем блокировки повторного складывания шпильки, тем самым сохраняя сигнал натяжения и генерируя накопленную карту натяжения. Кроме того, блокирующая цепь имеет восьминуклеотидную опору, которая обеспечивает реакцию смещения цепи, опосредованную опорой на носок, с ее полным дополнением, «разблокирующей» нитью. С добавлением отпирающей пряди связанная фиксирующая прядь снимается с конструкции шпильки, стирая сохраненный сигнал натяжения и сбрасывая шпильку обратно в состояние реального времени.

Рисунок 1: Схема современных датчиков молекулярного натяжения. (A) Общая конструкция датчика молекулярного натяжения в реальном времени, (B) Нити для конструкции датчика натяжения на основе ДНК и (C) спроектированные датчики натяжения на основе ДНК и их переключение между состоянием реального времени и заблокированным состоянием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Основной протокол состоит из четырех основных разделов – подготовка олигонуклеотидов, подготовка поверхности, визуализация и анализ данных. Этот протокол был успешно продемонстрирован нашей лабораторией и другими в наивных и активированных OT-1 CD8+ Т-клетках, OT-II CD4⁺ клетках, а также гибридомах и может применяться для опроса различных рецепторов иммунных клеток, включая рецептор Т-клеток, рецептор запрограммированной клеточной смерти (PD1) и силы антигена 1, связанного с функцией лимфоцитов (LFA-1). OT-1 CD8⁺ наивные Т-клетки используются в качестве примера клеточной линии в этой статье.

Protocol

Трансгенные мыши OT-1 размещены в Отделе ресурсов животных в Университете Эмори. Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC). 1. Олигонуклеотидный препарат Раствори?…

Representative Results

Здесь мы показываем репрезентативные изображения контроля качества поверхности (рис. 4). Высококачественная поверхность должна иметь чистый фон в канале RICM (рис. 4B) и равномерную интенсивность флуоресценции в канале Cy3B (рис. 4C). При одинак?…

Discussion

С помощью подробных процедур, представленных здесь, можно подготовить субстраты зонда натяжения шпильки ДНК для картирования и количественной оценки напряжения рецепторов, продуцируемого иммунными клетками. Когда клетки наносятся на подложку зонда натяжения шпильки ДНК, они приземл…

Materials

3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal