DNA-spänningssonder för att kartlägga de övergående piconewtonreceptorkrafterna av immunceller

Summary

Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att använda DNA-baserade spänningssonder för att avbilda receptorkrafterna som appliceras av immunceller. Detta tillvägagångssätt kan kartlägga receptorkrafter >4.7pN i realtid och kan integrera krafter över tid.

Abstract

Mekaniska krafter som överförs vid korsningen mellan två angränsande celler och vid korsningen mellan celler och den extracellulära matrisen är avgörande för att reglera många processer som sträcker sig från utveckling till immunologi. Därför är det viktigt att utveckla verktygen för att studera dessa krafter i molekylär skala. Vår grupp utvecklade en serie molekylära spänningssensorer för att kvantifiera och visualisera de krafter som genereras av celler och överförs till specifika ligander. Den känsligaste klassen av molekylära spänningssensorer består av nukleinsyrastamslinga hårnålar. Dessa sensorer använder fluorofor-släckarpar för att rapportera om den mekaniska förlängningen och utvecklingen av DNA-hårnålar som är i kraft. En utmaning med DNA-hårnålsspänningssensorer är att de är reversibla med snabb hårnålsvikning vid avslutad spänning och därmed är övergående krafter svåra att registrera. I den här artikeln beskriver vi protokollen för att förbereda DNA-spänningssensorer som kan “låsas” och förhindras från att vikas om för att möjliggöra “lagring” av mekanisk information. Detta möjliggör inspelning av mycket övergående piconewtonkrafter, som därefter kan “raderas” genom tillsats av komplementära nukleinsyror som tar bort låset. Denna förmåga att växla mellan spänningskartläggning i realtid och mekanisk informationslagring avslöjar svaga, kortlivade och mindre rikliga krafter, som vanligtvis används av T-celler som en del av deras immunfunktioner.

Introduction

Immunceller försvarar sig mot patogener och cancerceller genom att kontinuerligt krypa och skanna målcellernas ytor för antigener, studding deras yta ^1,2. Antigenigenkänning initieras vid bindning mellan T-cellreceptorn (TCR) och det peptid-stora histokompatibilitetskomplexet MHC (pMHC) -komplexet uttryckt på ytan av målceller. Eftersom TCR-pMHC-igenkänning sker vid korsningen mellan två mobila celler har den länge misstänkts för att uppleva mekaniska krafter. Dessutom ledde detta till mekanosensormodellen för TCR-aktivering, vilket tyder på att TCR-krafter bidrar till dess funktion ^3,4. För att förstå när, var och hur mekaniska krafter bidrar till T-cellernas funktion är det absolut nödvändigt att utveckla verktyg för att visualisera de molekylära krafter som överförs av T-celler. Traditionellt används metoder som dragkraftmikroskopi (TFM) och mikropelarrayer för att undersöka cellulära krafter ^5,6. Emellertid är kraftkänsligheten hos TFM- och mikropelarrayer på nanonewton (nN) -skalan och är därför ofta otillräcklig för att studera molekylära piconewton (pN) -krafter som överförs av cellreceptorer⁷. För att förbättra kraften och den rumsliga upplösningen för detektion var vårt laboratorium banbrytande för utvecklingen av molekylära spänningsprober, som ursprungligen syntetiserades med användning av polyetylenglykol (PEG) polymerer⁷. Molekylära spänningsprober består av en utdragbar molekylär “fjäder” (PEG, protein, DNA) flankerad av en fluorofor och släckare och förankras på en yta. Krafter som appliceras på sondens ändpunkt leder till dess förlängning, separerar fluoroforen och släckaren och genererar därmed en stark fluorescenssignal (figur 1A)^8,9,10.

Under det senaste decenniet har vi utvecklat ett bibliotek av olika klasser av molekylära spänningsprober med fjäderelement tillverkade av nukleinsyror¹¹, proteiner¹⁰ och polymerer⁸. Bland dessa ger de DNA-baserade spänningsproberna det högsta signal-brusförhållandet och den största kraftkänsligheten, som enkelt ställs in från några pN upp till ~ 20 pN¹¹. Vi har använt dessa DNA-spänningsprober i realtid för att studera de molekylära krafterna som genereras av många olika celltyper, inklusive fibroblaster, cancerceller, blodplättar och immunceller^11,12,13. Detta manuskript kommer att beskriva protokoll för att syntetisera och montera DNA-spänningsprober på en yta för att kartlägga molekylära receptorkrafter med pN-kraftupplösning med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop. Medan det nuvarande förfarandet inkluderar kemiska modifieringar av nukleinsyran för att introducera den fluorescerande reportern (figur 1B), är det viktigt att notera att många av modifierings- och reningsstegen kan outsourcas till anpassade DNA-syntesföretag. Därför är DNA-spänningsprober teknik lätt och tillgänglig för de bredare cellbiologi- och mekanobiologiska samhällena.

Kortfattat, för att montera DNA-spänningssensorer, hybridiseras en DNA-hårnål till en fluorescerande ligandsträng på ena armen och en släckarankarsträng på den andra armen och immobiliseras sedan på ett glassubstrat (Figur 1C, realtidsspänning). I frånvaro av mekanisk kraft stängs hårnålen och fluorescensen släckes. Men när den applicerade mekaniska kraften är större än F_1/2 (kraften vid jämvikt som leder till en 50% sannolikhet för utfällning) smälter hårnålen mekaniskt och en fluorescerande signal genereras.

Med utgångspunkt i DNA-spänningssensorn i realtid beskriver vi också protokoll för att kartlägga ackumulerade krafter, vilket är särskilt användbart för att studera interaktioner mellan receptorer på immunceller och deras naturliga ligand. Detta beror på att immunreceptorer ofta uppvisar kortlivade bindningar ^3,14. Ackumulerade krafter avbildas med hjälp av en “låsande” sträng som företrädesvis binder till öppna DNA-hårnålar och möjliggör lagring av fluorescenssignaler associerade med mekaniska draghändelser (figur 1C, låst spänning). Låssträngen är utformad för att binda ett kryptiskt bindningsställe som exponeras vid mekaniskt inducerad smältning av hårnålen och låsa hårnålen i öppet tillstånd genom att blockera hårnålens omvikning, vilket lagrar spänningssignalen och genererar en ackumulerad spänningskarta. Dessutom är låssträngen utformad med en åtta-nukleotid-tåhållare, vilket möjliggör en tåhållmedierad strängförskjutningsreaktion med sitt fulla komplement, den “upplåsta” strängen. Med tillägget av upplåsningssträngen avlägsnas den bundna låssträngen från hårnålskonstruktionen, raderar den lagrade spänningssignalen och återställer hårnålen till realtidsläget.

Figur 1: Schema för de toppmoderna molekylära spänningsproberna . (A) Allmän design av molekylär spänningssond i realtid, (B) strängar för den DNA-baserade spänningssondkonstruktionen, och (C) konstruerade DNA-baserade spänningssonder och deras växling mellan realtidstillstånd och låst tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Huvudprotokollet består av fyra huvudsektioner – oligonukleotidberedning, ytbehandling, avbildning och dataanalys. Detta protokoll har framgångsrikt demonstrerats av vårt laboratorium och andra i naiva och aktiverade OT-1 CD8 ⁺ T-celler, OT-II CD4 ⁺ -celler, såväl som hybridom, och kan tillämpas för att förhöra olika immuncellreceptorer inklusive T-cellreceptor, programmerad celldödsreceptor (PD1) och lymfocytfunktionsassocierad antigen 1 (LFA-1) krafter. OT-1 CD8 ⁺ naiva T-celler används som exempel cellinje i detta papper.

Protocol

OT-1 transgena möss är inrymda vid avdelningen för djurresurser vid Emory University. Alla experiment godkändes och utfördes enligt IACUC-protokollet (Institutional Animal Care and Use Committee). 1. Oligonukleotidpreparat Lös upp ligandsträngens DNA i vatten (18,2 MΩ resistivitet, används i hela protokollet). Vortex och snurra ner lösningen med en bordscentrifug. Ställ in vattenvolymen så att den slutliga koncentrationen är 1 mM. Validera koncentrationen med hjälp av e…

Representative Results

Här visar vi representativa bilder för ytkvalitetskontroll (figur 4). En yta av hög kvalitet bör ha en ren bakgrund i RICM-kanalen (figur 4B) och enhetlig fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med samma bildutrustning och identiska fluorescensbildningsförhållanden bör bakgrundsfluorescensintensiteten vara konsekvent och reproducerbar varje gång vid experiment med DNA-sonder. Vi rekommenderar att du använder den s…

Discussion

Med de detaljerade procedurerna som tillhandahålls här kan man förbereda DNA-hårnålsspänningssondsubstrat för att kartlägga och kvantifiera receptorspänningen som produceras av immunceller. När celler pläteras på DNA-hårnålsspänningssondsubstratet landar, fäster och sprider de sig när receptorerna känner av liganderna både kemiskt och mekaniskt, varav den senare detekteras av våra sonder. I vissa fall kan celler dock misslyckas med att sprida sig (Figur 7A) eller misslyck…

Materials

3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal