Delvis Hepatektomi hos voksne sebrafisk

Summary

Denne protokollen beskriver prosedyren for å fjerne leverens ventrale lobe i voksen sebrafisk for å muliggjøre studiet av leverregenerering.

Abstract

Leversvikt er en av de ledende dødsårsakene over hele verden, og dødeligheten av kronisk leversykdom øker kraftig i USA. Sunn lever er i stand til å regenerere fra giftig skade, men i avansert leversykdom er leverens naturlige evne til å regenerere svekket. Sebrafisk har dukket opp som et kraftig eksperimentelt system for å studere regenerering. De er en ideell modell for å studere leverregenerering fra delvis hepatektomi, en prosedyre med direkte klinisk relevans der en del av leveren er kirurgisk fjernet, slik at resten er intakt. Det finnes ingen standardprotokoll for delvis hepatektomi. tidligere studier med denne modellen har brukt litt forskjellige protokoller og rapportert ulike resultater. Beskrevet her er en effektiv, reproduserbar protokoll for å utføre en delvis hepatektomi hos voksen sebrafisk. Vi bruker denne teknikken for å demonstrere at sebrafisk er i stand til epimorfisk regenerering av den resected lobe. Denne protokollen kan brukes til å forhøre mekanismene som kreves for leverregenerering i sebrafisk ytterligere.

Introduction

Blant de faste organene hos mennesker er leveren det eneste organet som er i stand til regenerering¹. Dette er kritisk, da leveren er et viktig organ, ansvarlig for viktige metabolske funksjoner, energilagring, blod avgiftning, sekresjon av plasmaproteiner og galleproduksjon². Hepatocytter tapt på grunn av giftig eller inflammatorisk skade erstattes hovedsakelig via deling av de resterende hepatocyttene¹. En klassisk eksperimentell modell for å studere leverregenerering er delvis hepatektomi, hvor individuelle lober i leveren fjernes, slik at de resterende lobene er^{intakte 3}. Denne prosedyren ble opprinnelig utviklet hos rotter, hvor omtrent to tredjedeler av levermassen fjernes. Etter delvis hepatektomi hos pattedyr oppstår kompenserende regenerering i de resterende lobes til leveren gjenoppretter sin opprinnelige masse. Spesielt erstatter pattedyrlever ikke de manglende lobene.

Sebrafisk (Danio rerio) representerer en omsettelig modell for å studere voksen organregenerering⁴. Sebrafiskleveren, mens den er strukturelt forskjellig fra pattedyrleveren, består av samme celletyper og tjener samme funksjon som hos pattedyr². Den består av tre lober, med to dorsale lober og en enkelt ventral lobe som er flatt langs tarmen. Delvis hepatektomi har tidligere blitt utført i sebrafisk, med motstridende kontoer om den nøyaktige regenereringsmodusen. Vanligvis utføres en tredjedel delvis hepatektomi ved fjerning av hele ventral lobe. Innledende rapporter indikerte at etter fjerning av ventral lobe, ble den fullstendig regenerert innen en uke^5,6,7, noe som tyder på at i motsetning til pattedyrleveren er sebrafiskleveren i stand til epimorfisk regenerering. Etterfølgende studier viste at fjerning av ventral lobe resulterte i kompenserende regenerering i dorsale lober, i stedet for regenerering av den manglende ventral lobe, og til slutt utvinning av levermasse innen en uke^8,9. Transkripsjonsprofilering av dorsale lober etter reseksjon av ventral lobe avslørte betydelige endringer forbundet med kompenserende regenerering¹⁰. Gitt at modusen for leverregenerering kan variere med skadeomfanget⁸, spekulerte vi i at avvikene i resultatene kan skyldes teknisk variasjon i den delvise hepatektomiprotokollen mellom forskningsgrupper.

Denne protokollen beskriver en prosedyre for å utføre en tredjedel delvis hepatektomi på voksen sebrafisk ved å fjerne ventral lobe. Denne teknikken vil være verdifull for å vurdere mekanismer for leverregenerering.

Protocol

Sebrafisk ble hevet og oppdrettet i henhold til standardprosedyrer. Eksperimenter ble godkjent av Brigham and Women’s Hospital’s Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Voksen sebrafisk ble fastet i 24 timer før starten av protokollen. Systemvann refererer til vannet i sebrafiskhustanker i vannanlegget. 1. Forberedelse og bedøvelse Forbered 0,016% trikainoppløsning i systemvann.FORSIKTIG: Trikain er irriterende hvis den kommer i kontakt med øyne, hud eller …

Representative Results

For å undersøke det regenerative potensialet til den voksne sebrafiskleveren, utførte vi delvis hepatektomi (PHX) hos voksen sebrafisk. Generelt ble store voksne (30-40 mm lange) valgt, alt fra 1,5-2,5 år. Innenfor individuelle eksperimenter ble dyr valgt ut fra samme tank, og var alders- og størrelsestilpasset. Som en passende kontroll brukte vi skamoperasjoner der dyret både ble bedøvet og fikk et stort snitt i ventral kroppsvegg, men ble gjenopprettet uten å fjerne noe vev. Overlevelsesraten for sham-kontrolle…

Discussion

De anatomiske forskjellene mellom sebrafisk og pattedyrmodeller for leverregenerering gir unike utfordringer for leverreseksjon. Leveren i sebrafisk er i nærheten av hjertet og tarmen; utilsiktet skade på begge organene resulterer i økt dødelighet. Sebrafiskleveren er ikke innkapslet, noe som gjør det vanskeligere å skille seg fra tarmen. Leveren mottar næringsrikt blod fra tarmen gjennom portalårer. Hos pattedyr konvergerer årer som forlater tarmen på en primær portalåre som deretter deler seg når den komme…

Materials

16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500