Summary
Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.
Abstract
A insuficiência hepática é uma das principais causas de morte em todo o mundo, e a mortalidade por doença hepática crônica está aumentando acentuadamente nos Estados Unidos. Fígados saudáveis são capazes de se regenerar de danos tóxicos, mas em doença hepática avançada, a capacidade natural do fígado de se regenerar é prejudicada. Os zebrafish emergiram como um poderoso sistema experimental para estudar a regeneração. São um modelo ideal para estudar a regeneração hepática a partir da hepatectomia parcial, procedimento com relevância clínica direta em que parte do fígado é removida cirurgicamente, deixando o resto intacto. Não há protocolo padrão para hepatectomia parcial; estudos anteriores utilizando este modelo têm usado protocolos ligeiramente diferentes e relatado resultados diferentes. Descrito aqui é um protocolo eficiente e reprodutível para a realização de uma hepatectomia parcial em zebrafish adulto. Usamos esta técnica para demonstrar que os zebrafish são capazes de regeneração epimórfica do lobo ressecado. Este protocolo pode ser usado para interrogar ainda mais os mecanismos necessários para a regeneração hepática em zebrafish.
Introduction
Entre os órgãos sólidos em humanos, o fígado é o único órgão capaz de regenerar1. Isso é crítico, pois o fígado é um órgão essencial, responsável pelas principais funções metabólicas, armazenamento de energia, desintoxicação sanguínea, secreção de proteínas plasmáticas e produção de bile2. Hepatócitos perdidos devido a danos tóxicos ou inflamatórios são substituídos principalmente por divisão dos hepatócitos restantes1. Um modelo experimental clássico para estudar a regeneração hepática é a hepatectomia parcial, onde os lobos individuais do fígado são removidos, deixando os lóbulos restantes intactos3. Este procedimento foi inicialmente desenvolvido em ratos, nos quais aproximadamente dois terços da massa hepática é removida. Após hepatectomia parcial em mamíferos, a regeneração compensatória ocorre nos lóbulos restantes até que o fígado recupere sua massa inicial. Notavelmente, o fígado mamífero não substitui os lóbulos perdidos.
O zebrafish (Danio rerio) representa um modelo tratável para estudar a regeneração de órgãosadultos 4. O fígado de zebrafish, embora estruturalmente diferente do fígado mamífero, é composto pelos mesmos tipos de células e serve a mesma função dos mamíferos2. É composto por três lóbulos, com dois lobos dorsais e um único lobo ventral que são achatados ao longo do intestino. A hepatectomia parcial já foi realizada anteriormente em zebrafish, com relatos conflitantes quanto ao modo preciso de regeneração. Normalmente, uma hepatectomia parcial de um terço é realizada pela remoção de todo o lobo ventral. Relatórios iniciais indicaram que, após a remoção do lobo ventral, ele foi totalmente regenerado dentro de uma semana5,6,7, sugerindo que, em contraste com o fígado mamífero, o fígado de zebrafish é capaz de regeneração epimórfica. Estudos subsequentes demonstraram que a remoção do lobo ventral resultou em regeneração compensatória nos lobos dorsais, em vez da regeneração do lobo ventral perdido, e, finalmente, a recuperação da massa hepática dentro de uma semana8,9. O perfil transcriômico dos lobos dorsais após a ressecção do lobo ventral revelou alterações significativas associadas à regeneração compensatória10. Dado que o modo de regeneração hepática pode variar com a extensão da lesão8,especulamos que as discrepâncias nos resultados podem ser devido à variação técnica no protocolo de hepatectomia parcial entre grupos de pesquisa.
Este protocolo descreve um procedimento para a realização de uma hepatectomia parcial de um terço em zebrafish adulto, removendo o lobo ventral. Esta técnica será valiosa para avaliar mecanismos de regeneração hepática.
Protocol
Representative Results
Discussion
As diferenças anatômicas entre zebrafish e modelos mamíferos para regeneração hepática apresentam desafios únicos à ressecção hepática. O fígado em zebrafish está próximo do coração e do intestino; inadvertidamente danificar qualquer órgão resulta em aumento da mortalidade. O fígado de zebrafish não é encapsulado, tornando mais difícil separar-se do intestino. O fígado recebe sangue rico em nutrientes do intestino através de veias portal. Nos mamíferos, veias que saem do intestino convergem em um…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. é apoiado pela NIAAA (F32AA027135). W.G. é suportado por R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e pelo Programa Claudia Adams Barr de Excelência em Pesquisa do Câncer. W.G. é um estudioso de Ciências Biomédicas.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
Riferimenti
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Biologia dello sviluppo. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
