Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking
Summary
We presenteren een protocol voor de karakterisering van beweeglijkheid en gedrag van een populatie van honderd micron- tot millimetergrote cellen met behulp van brightfield-microscopie en celtracking. Deze test onthult dat Stentor coeruleus door vier gedragsmatig verschillende fasen gaat bij het regenereren van een verloren oraal apparaat.
Abstract
Stentor coeruleus is een bekend modelorganisme voor de studie van eencellige regeneratie. Transcriptomische analyse van individuele cellen onthulde honderden genen – veel niet geassocieerd met het orale apparaat (OA) – die differentieel gereguleerd zijn in fasen tijdens het regeneratieproces. Er werd verondersteld dat deze systemische reorganisatie en mobilisatie van cellulaire middelen naar de groei van een nieuwe artrose zal leiden tot waarneembare veranderingen in beweging en gedrag die in de tijd overeenkomen met de fasen van differentiële genexpressie. De morfologische complexiteit van S. coeruleus maakte echter de ontwikkeling van een test noodzakelijk om de statistieken en de tijdschaal vast te leggen. Een aangepast script werd gebruikt om cellen in korte video’s te volgen en statistieken werden samengesteld over een grote populatie (N ~ 100). Bij verlies van de OA verliest S. coeruleus aanvankelijk het vermogen tot gerichte beweging; dan vanaf ~ 4 uur, vertoont het een aanzienlijke daling van de snelheid tot ~ 8 uur. Deze test biedt een nuttig hulpmiddel voor de screening van motiliteitsfenotypen en kan worden aangepast voor het onderzoek van andere organismen.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) is een bekend modelorganisme dat is gebruikt om eencellige regeneratie te bestuderen vanwege zijn grote omvang, vermogen om verschillende microchirurgische technieken te weerstaan en het gemak van kweken in een laboratoriumomgeving 1,2,3. Vroege regeneratiestudies richtten zich op het grootste en meest morfologisch onderscheidende kenmerk in Stentor – de OA – die volledig wordt afgeworpen op chemische shock 4,5,6. De novo vervanging van een verloren artrose begint met de opkomst van een nieuwe membraanllarband – een reeks trilharen die geleidelijk naar de voorste van de cel verschuiven voordat ze een functionele artrose vormen gedurende acht morfologische stadia3. Deze stadia zijn sequentieel waargenomen, ongeacht de temperatuur, en vormen een universeel referentiepunt voor bijna alle onderzoeken5.
Mechanistische analyse van Stentor-regeneratie vereist hulpmiddelen voor het meten van de timing van regeneratie die robuust en eenvoudig genoeg zijn om op meerdere monsters te worden toegepast als onderdeel van een chemisch of moleculair scherm. De standaardmethode voor het uitvoeren van een celgebaseerde test is beeldvorming, in dit geval het in beeld brengen van de vorming van nieuwe artrose tijdens regeneratie. Dergelijke op beeldvorming gebaseerde testen zijn echter het meest effectief wanneer de regenererende structuur verschillende moleculaire componenten bevat die als markers kunnen worden gebruikt, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd in een fluorescentiebeeld. In het geval van de Stentor OA zijn de bekende componenten (trilharen, basale lichamen) ook aanwezig op de rest van het celoppervlak; daarom kan het erkennen van het herstel van de OA niet worden bereikt door simpelweg te zoeken naar de aan- of afwezigheid van een component.
Integendeel, een vorm van vormherkenning zou nodig zijn om een artrose te detecteren, en dit is potentieel zeer uitdagend gezien het feit dat Stentor-cellen vaak van vorm veranderen via een snel contractiel proces. Dit artikel presenteert een alternatieve test voor regeneratie die afhankelijk is van de beweeglijke activiteit van het lichaam en OA-trilharen. Naarmate de OA regenereert, ondergaan de nieuw gevormde trilharen reproduceerbare veranderingen in positie en activiteit, die op hun beurt de zwemmotiliteit van de cel beïnvloeden. Door de beweeglijkheid te analyseren, is het mogelijk om een test uit te voeren voor “functionele regeneratie” die regeneratie kwantificeert door de functie van de geregenereerde structuren te kwantificeren. Eerdere analyse van de stentoriële functie tijdens de regeneratie maakte gebruik van deeltjesbeeld velocimetrie, gecombineerd met tracerparels toegevoegd aan de externe media, om veranderingen in het stromingspatroon in verschillende stadia van regeneratie waar te nemen7; deze aanpak vereist echter een moeizame beeldvorming van individuele cellen en hun bijbehorende stroomvelden, één voor één.
Door de beweging van de cel zelf te gebruiken als een proxy voor door trilharen gegenereerde stroom, zou het mogelijk zijn om grotere aantallen cellen parallel te analyseren, met behulp van beeldvormingssystemen met lage resolutie die compatibel zijn met screeningplatforms met hoge doorvoer. Deze test kan in principe worden gebruikt om ontwikkeling en functionele regeneratie in andere zwemmende organismen te bestuderen op een schaal van honderden micron tot millimeters. Sectie 1 van het protocol beschrijft de constructie van een multiwell-monsterdia, die een high-throughput beeldvorming van een populatie cellen over maximaal een hele dag mogelijk maakt. Er worden details gegeven over hoe u kunt aanpassen voor gebruik met andere celtypen. Sectie 2 van het protocol heeft betrekking op het verzamelen van videogegevens voor deze test, die kan worden uitgevoerd op een dissectiemicroscoop met een digitale spiegelreflexcamera met één lens. Sectie 3 van het protocol biedt een overzicht van celtracking en celsnelheidsberekening met behulp van MATLAB-code (aanvullende informatie). In hoofdstuk 4 van het protocol wordt uitgelegd hoe de numerieke resultaten kunnen worden omgezet in plots zoals weergegeven in figuur 1C-F en figuur 2C voor eenvoudige interpretatie van de resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er bestaan momenteel veel algoritmen voor het volgen van deeltjes en cellen, sommige volledig gratis. Kosten en gebruiksvriendelijkheid zijn vaak afwegingen die compromissen vereisen. Bovendien zijn veel van de bestaande celvolgprogramma’s ontworpen om de langzame kruipbeweging van weefselkweekcellen te volgen, in plaats van de snelle zwembeweging van Stentor, die tijdens het zwemmen roteert en plotselinge richtingsveranderingen kan ondergaan. Na het testen van veel van deze opties, is het hier gepresenteerde pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). We erkennen Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo en Skylar Widman voor hun hulp bij een deel van de voorlopige analyse en codetests. Wij danken Mark Slabodnick voor de discussie en suggesties. WFM erkent steun van NIH-subsidie R35 GM130327.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
Riferimenti
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V., Kerkut, G. A. . The Biology of Stentor. , (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
