Summary
我们提出了一种方案，用于使用明场显微镜和细胞跟踪来表征数百微米至毫米级细胞群的运动性和行为。该测定表明，在再生丢失的口腔器械时， Stentor coeruleus 通过四个行为上不同的阶段过渡。
Abstract
鞘翅目 是一种著名的单细胞再生研究模式生物。单个细胞的转录组学分析揭示了数百个基因 - 许多与口腔器官（OA）无关 - 这些基因在整个再生过程中的各个阶段受到差异调节。据推测，这种系统性重组和细胞资源向新OA生长的动员将导致运动和行为的可观察到的变化，这些变化与差异基因表达的各个阶段相对应。然而， Coeruleus 的形态复杂性使得有必要开发一种测定方法来捕获统计数据和时间尺度。使用自定义脚本在短视频中跟踪细胞，并在大量群体（N ~100）上编译统计数据。在OA丧失后， 科鲁勒斯链球菌 最初失去定向运动的能力;然后从~4小时开始，它表现出速度的显着下降，直到〜8小时。该测定法为筛选运动表型提供了有用的工具，并且可以适用于其他生物体的研究。
Introduction
Stentor coeruleus （Stentor）是一种众所周知的模式生物，由于其体积大，能够承受多种显微外科技术并且易于在实验室环境中培养，因此已被用于研究单细胞再生1，2，3。早期的再生研究集中在 Stentor中最大和形态上最独特的特征 - OA - 它在化学休克4，5，6时完全脱落。从 头 替换丢失的OA始于新膜束带的出现 - 一组纤毛，在八个形态阶段形成功能性OA之前逐渐向细胞前部移动3。无论温度如何，这些阶段都是按顺序观察到的，并为几乎所有研究提供了通用参考点5。
Stentor再生的机械分析需要用于测量再生时间的工具，这些工具足够坚固且简单，可以作为化学或分子筛选的一部分应用于多个样品。进行基于细胞的测定的标准方法是成像，在这种情况下，在再生过程中成像新OA的形成。然而，当再生结构包含可用作标记物的不同分子组分时，这种基于成像的测定是最有效的，因此它们很容易在荧光图像中检测到。在Stentor OA的情况下，已知的成分（纤毛，基底体）也存在于细胞表面的其余部分;因此，识别OA的恢复不能仅仅通过寻找组件的存在与否来实现。
相反，需要某种形式的形状识别来检测OA，鉴于 Stentor 细胞经常通过快速收缩过程改变形状，这可能非常具有挑战性。本文提出了一种依赖于身体和OA纤毛的运动活性的再生替代测定方法。随着OA的再生，新形成的纤毛在位置和活性上经历可重复的变化，这反过来又会影响细胞的游动性。通过分析运动性，可以进行“功能再生”的测定，通过量化再生结构的功能来量化再生。先前对再生过程中 Stentor 纤毛功能的分析使用粒子图像测速法，结合添加到外部介质中的示踪剂珠，以观察再生不同阶段流动模式的变化7;然而，这种方法需要对单个细胞及其相关的流场进行费力的成像，一次一个。
通过使用细胞本身的运动作为纤毛生成流动的代理，可以使用与高通量筛选平台兼容的低分辨率成像系统并行分析大量细胞。原则上，该测定可用于研究其他游泳生物体在数百微米至毫米大小的规模的发育和功能再生。该协议的第1部分描述了多孔样品载玻片的构造，该载玻片允许在长达一整天的时间内对细胞群进行高通量成像。提供了有关如何调整以用于其他细胞类型的详细信息。该协议的第2部分涵盖了该测定的视频数据的采集，这可以在带有数字单镜头反光相机的解剖显微镜上完成。该协议的第3部分提供了使用MATLAB代码（补充信息）进行细胞跟踪和细胞速度计算的演练。该协议的第4部分解释了如何将数字结果转换为图1C-F和图2C所示的图，以便于解释结果。
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Protocol
注意：根据先前发表的JoVE方案8培养了大约100个科鲁勒斯链球菌细胞。
1. 样品制备
- 切割一块250μm厚的硅胶间隔片（材料表），其高度和宽度都比显微镜载玻片略小。使用 5/16“ 打孔机，创建圆形孔。注意在相邻的井之间留出足够的空间，以确保良好的密封性。
注：发现相邻井之间3毫米的空间就足够了。通过练习，可以将十口孔放置在单个样品载玻片上。 - 通过将细胞在10%蔗糖或2%尿素中孵育2分钟来启动OA的再生（图1A）。然后，用新鲜的培养基洗涤三次8.轻轻地将大约十 个Stentor 移入每个孔中。注意尽可能将样品体积与孔体积相匹配。
注意：对于此处使用的孔尺寸，将12.5μL样品移液到每个孔中。 - 从一个边缘开始，轻轻地将一块盖玻片（参见 材料表）放在孔上，以关闭孔。使用狭窄且略微柔韧的物体（例如10 μL移液器吸头）向下压在与硅胶片接触的盖玻片上，以确保良好的密封性。
2. 可见光显微镜延时摄影
- 将样品放在显微镜载物台上，并将放大倍率设置为可用的最低倍率，以便一个孔完全适合框架。
注意：对于该协议，显微镜上使用1.6倍相机适配器和1倍放大倍率。 - 开始延时摄影。在每个时间点以每秒30帧的速度采集每个孔的10秒视频。如果使用带有电动X-Y载物台的显微镜设置，请自动执行整个延时摄影。否则，请确保用户在每个时间点都在场，以手动转换样本以记录每个孔。
注意：避免在未成像时使样品发光，以避免加热和蒸发。样品体积小，蒸发会导致气泡。 - 将影片另存为动画、移动观看或视频。
注意：这些是最常见的非专有视频文件类型。根据特定的显微镜软件，视频可能会默认保存为专有文件类型，但随后可以导出为上述文件类型之一。 - 使用像素到毫米的转换因子进行物理缩放，然后执行校准或使用所用相机中的已知像素大小。要进行校准，请以与视频相同的放大倍率设置获取校准载玻片的清晰图像或清晰的标尺。使用任何图像查看程序，计算已知物理距离的标记之间的像素数。
注意：例如，如果标尺的图像显示要用 100 像素分隔的 1 mm 标记和 2 mm 标记，则转换因子为每 100 像素 1 mm。或者，要从相机像素大小推导出此因子，只需将相机像素大小乘以放大倍率即可。例如，如果使用的相机具有3.45 μm像素，并且使用的放大倍率为1.6x，则转换为3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm/1像素。
3. 细胞追踪
- 将两个脚本 “跟踪细胞” 和 “清除跟踪”下载到计算机上一个易于记忆的位置。如果此计算机上尚有数据视频，请将其传输到此计算机上。
注意：数据视频和脚本不需要位于同一文件夹中。 - 将数据视频组织到文件夹中，每个时间点一个。首先使用脚本 “跟踪细胞”在 数据视频中执行自动细胞跟踪。打开 跟踪细胞并 运行脚本。
- 如果弹出窗口提示，请选择“ 添加到路径 ”，这通常仅在首次从给定文件夹运行脚本时发生。出现提示时， 选择一个或多个数据视频以启动跟踪，导航到数据视频（第 2 部分）。通过使用 移位单击、按住 Control 单击或在文件上移动时按住 鼠标左键 以突出显示它们来选择多个视频文件。
- 对提示窗口底部的“ 文件名： ”框中的文件列表感到满意后，单击“ 打开”。首先对一个视频执行测试运行，以确认所有参数均已正确设置（请参阅下面的讨论）。
注意：此脚本现在将为所选的每个视频文件创建一个文件夹。然后，它将视频的每一帧作为.jpg文件和名为 position_estimates.mat的文件写入此文件夹，其中包含视频中找到的所有痕迹。根据视频的大小、视频数量和计算机的速度，此脚本可能需要数小时才能运行。
4. 跟踪验证
- 在继续之前，通过检查没有错误消息，验证是否正确遵循了第 3 节中描述的步骤。使用“清除跟踪”.m 脚本手动拒绝异常或错误的跟踪。在 MATLAB 编辑器窗口中通过双击该文件打开“清理跟踪”。
- 在提示符 下，通过跟踪细胞选择数据文件夹输出。它将具有与视频文件相同的名称，导航到第3节中所述创建的文件夹之一。仅选择一个文件夹。
注意：此脚本现在将在弹出窗口中逐个显示跟踪。它们以绿色覆盖在跟踪开始的视频帧上，以洋红色表示跟踪结束的视频帧上。因此，有效的跟踪应链接绿色单元格和洋红色单元格。 - 出现提示时，输入 1 以保留跟踪，输入 0 以拒绝跟踪。按 Enter 键转到下一个跟踪。
注意：新跟踪将继续显示，直到不再显示跟踪或显示前 60 个跟踪。完成此过程后，脚本将自动创建一个名为 CLEAN TRACES 的文件夹，用于保存输出，并在视频的第一帧顶部显示所有剩余的跟踪（图 1B）。此图像将自动另存为 标记跟踪.png 以供将来参考。用户选择保留的所有跟踪都将保存在文件 clean_traces.mat 中。 - 在一个时间点完成所有视频的此步骤，然后再继续。
注：对于本手稿中的数据，在每个时间点为每口井获取了一段视频，每个时间点总共有十个视频。
5. 数据可视化
注意：为了直观地比较不同时间点内整个细胞群的运动，第4节的所有迹线都被翻译为从原点开始，并为每个时间点创建一个径向位移与时间的关系图（图1C-F，参见所有时间点的补充图S1）。
- 首先下载标题为“ 意大利面条情节”的脚本。打开并运行脚本。当弹出一个窗口文件浏览器窗口并提示 选择包含要绘制的油井数据的时间文件夹（clean_traces.mat）时，导航到其中一个时间点的文件夹。请注意，此文件夹中应包含每个分析视频的文件夹。
- 当提示 校准：每毫米的像素数是多少？，键入步骤 2.4 中找到的校准值，然后按 Enter 键。
注意：该脚本现在将在此时间点将所有分析视频中的迹线合并到单个图中（图1C-F）。图中淡淡的虚线圆圈表示径向位移为 1、2、3 和 4 mm。 - 根据需要通过更改脚本的第 55 行来调整绘图的轴，默认情况下，该行设置为 rr = 4 ，以包括最大 4 mm 的半径。保存绘图。
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Representative Results
该测定的目的是量化运动模式的逐渐变化和大型（N〜100）再生Stentor群体中细胞运动速度的逐步增加。为了帮助解释结果，该协议中包含的自定义代码生成两种类型的图：一组视频数据中所有细胞运动迹线的叠加（图1C-F和图S1），以及自再生开始以来按小时划分的游泳速度图（图2C）。正常再生的Stentor群体应表现出从无方向游泳到定向游泳的稳定过渡（图1G）。虽然每个细胞在持续约8小时的OA再生过程中完全经历这种转变，但个体之间的差异需要观察大量种群的移动，以便趋势变得清晰。
图1C-F显示了同一群体的Stentor细胞在OA再生过程中2，3，7和8小时的集体运动。这些图显示了运动个体数量的预期增加（可见迹线的数量）和群体中运动性最强的细胞范围增加四倍（径向位移）。需要注意的是，图1C-F的不同面板之间的轴是不同的，选择1毫米（小时2），2毫米（小时3和7小时）和4毫米（小时8）作为最合适的运动。在2小时（最早的时间点）时，在10秒的视频中，没有细胞移动超过1毫米，而在9小时时，许多细胞在相同的时间长度内移动超过5毫米。补充图S1提供了这些全延时曲线的曲线，所有图都使用相同的轴，以便更清楚地了解成功实验中运动的预期增加。
对此示例系列图的解释有一个警告。最快的游泳细胞能够在视频中游过井，特别是如果它们（偶然）开始靠近边缘;因此，它们被限制完全在一条直线上游泳，并且它们的运动范围，以这种方式可视化，将显得更小。虽然这确实使量化细胞行进距离的任何尝试复杂化，但它并没有改变运动范围在至少8小时内增加的定性趋势。这与已知的形态再生时间表（图2A）3一致。
为了编制人口统计数据，将追踪的细胞分为三个不同的类别：没有可见保持的非运动，具有可见保持的非运动和运动。这些行为类别以前由Tartar定义，但从未量化其随时间推移的流行率3。 图2B 显示了一个堆叠直方图，总结了这些类别中的相对细胞计数作为再生时间的函数。在所有时间点，超过一半的细胞群没有观察到运动。此外，在后来的时间里，在具有可见保持力的菌落中发现了相当多的细胞，强烈表明它们已经探索了环境并优先附着在同类细胞附近。图 2C的最终插图中显示了这方面的一个例子。
该测定允许在运动恢复的每个阶段对游泳速度进行统计比较。 图2C 中所示数据的平均值和标准偏差总结如下（表1）。一旦通过细胞追踪提取了这些统计量，就可以使用未配对的t检验严格比较不同阶段的细胞群所表现出的运动。作为具体示例，对于所示数据，比较阶段 1 和阶段 2 中游泳速度的 t 统计量计算公式为：
其中 x1 和 x2 分别表示阶段 1 和阶段 2 期间的平均速度; s1 和 s2 分别表示阶段 1 和阶段 2 期间速度的标准偏差; n1 和 n2 分别表示在阶段 1 和阶段 2 中提取的迹线数。然后，可以将得到的 t 统计量 t12 转换为 p 值以进行假设检验。对于 图2C所示的数据，从阶段1到阶段2（p<0.1%）和从阶段2到阶段3（p<0.1%）的转换在统计上是显着的，而从阶段3到阶段4（p>20%）的转换则不是。重要的是要注意，细胞在第4阶段（图2B，插图）中沉降成小集落的趋势，如原始视频中所示，是行为差异的一个例子，仅通过测量游泳速度并不能很好地捕获。这解释了在第4阶段（0.26 mm / s）期间测量到的大标准偏差，这反过来又导致与阶段3进行比较时 t统计量较低。
图1：细胞追踪显示定向游泳逐渐恢复（A）蔗糖休克诱导黄曲霉菌脱落膜束带。（B）在10秒视频中再生细胞的示例跟踪结果，条纹圆圈指示井中的气泡。（中-楼）在2小时，3小时，7小时和8小时覆盖所有轨迹。在编译数据期间，时间被舍入到最接近的小时。虚线圆表示一毫米的径向位移。（G）细胞运动从以短圆轨迹为特征的无方向游泳演变为以长正弦轨迹为特征的定向游泳。请点击此处查看此图的大图。
图2：运动亚群通过OA再生展示了四个不同的行为阶段。（B） 每次（蓝色）不运动、无明显保持的细胞的归一化计数;（橙色）不运动，具有可见的保持;（绿色）运动。此图合并了跨越不同小时子集的多个数据集，因此每小时的总像元计数范围为 57 到 376 以上。图例显示每个类别下的代表性单元格，通过假色（以洋红色和绿色）显示。（C） 游泳速度的箱线图;框每次从 Q1 扩展到 Q3 四分位数值，中位数以绿色表示。散射叠加是每个运动单元的平均速度。插图显示了四个阶段中每个阶段的代表性人口行为。缩写：OA =口腔器械;Q1 = 第一个四分位数;Q3 = 第三个四分位数。请点击此处查看此图的大图。
（A，B）在12小时时跟踪两个孔的结果（C，D）在18小时时跟踪来自相同两个孔的结果。条纹区域表示井中有气泡。请点击此处查看此图的大图。
| 平均值（毫米/秒） | 标准偏差（毫米/秒） | |
| 第 1 阶段 | 0.14 | 0.24 |
| 第 2 阶段 | 0.06 | 0.13 |
| 第 3 阶段 | 0.16 | 0.16 |
| 第 4 阶段 | 0.15 | 0.26 |
表1：运动恢复每个阶段的游泳速度比较。
补充图S1：通过再生和超越的种群游泳模式。 （上午-上午）口腔器官再生开始后， 鞘翅目 细胞2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，13，14，16和18小时的运动。 请按此下载此档案。
补充视频1-3：用于脚本调试的科鲁勒斯链球菌的显微镜视频示例。协议的第5部分可以对这组三个数据视频执行，以快速确认脚本是否正常运行。此外，这些视频还提供了数据视频对比度和分辨率要求的具体示例。请按此下载此档案。
补充文件：请点击此处下载此文件。
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Discussion
目前存在许多粒子和细胞跟踪算法，其中一些是完全免费的。成本和用户友好性通常是需要妥协的权衡。此外，许多现有的细胞跟踪程序被设计为跟踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而不是Stentor的快速游泳运动， Stentor在游泳时旋转并可能经历突然的方向变化。在测试了许多这些选项之后，这里介绍的协议旨在成为一站式解决方案，仅使用低成本设备和单个科学软件包（材料表）即可从数据采集到数据可视化。对于以教学为重点的机构或生物物理教学实验室的研究实验室来说，这尤其重要，因为大多数所需的设备已经可用，因为它降低了学生提出自己的问题并在短时间内获得定量结果的障碍。
本手稿中介绍的方法可以用于定量表征一百微米至毫米大小范围内的生物种群的运动性。应用于较小或较大的生物体将需要改变视频数据的采集方式。当应用于再生的 Coeruleus 群体时，该协议产生了一个在整个细胞群中运动功能恢复的时间表，这补充了目前已知的转录时间表。例如，从RNA测序中可以知道，编码纤毛运动蛋白的基因的合成直到几个小时后才进入再生过程，在纤毛本身形成9，10很久之后。上述证明的从0-3小时（第1阶段）到第4小时（第2阶段）的运动性下降具有统计学意义，与参与睫状体组装的基因的表达相比，睫状体运动因子的表达滞后是一致的。迄今为止，还没有对 Stentor 再生进行过转录组学研究，因此对基因组活性知之甚少。第8-10小时（第3阶段）和第11小时以上（第4阶段）之间缺乏统计学上的显着差异，表明细胞此时已经完全再生，并且很少有与细胞运动相关的基因应该在第9小时之后进行差异调节。
这种方法的两个主要限制是它无法跟踪聚集和/或触摸的细胞，以及它无法量化比游泳速度或轨迹更复杂的运动方面。所有粒子/细胞跟踪算法都难以跟踪被另一个细胞暂时视觉阻挡的细胞，并且当多个细胞在近距离花费多个帧时;此处包含的脚本也不例外。幸运的是，前者的频率可以通过限制放置在一个井中的单元格的数量来有效地降低，如下一段所述。特别是对于这里研究的 科鲁勒斯链球菌 群体，他们倾向于在菌落中定居（图3）导致其中一些细胞无法被脚本识别。然而，由于所有这些细胞几乎不表现出运动，因此运动细胞群的统计数据不受影响。此外，多个细胞无法跟踪的视频很容易识别，并手动从进一步分析中排除。关于运动复杂方面的量化， 补充图S1 中从无方向游泳到定向游泳的转变表明方向，平均加速度和其他潜在可测量的时间相关性发生了定量变化。速度和范围是该协议中分析的唯一数量，仅代表运动的一小部分。
最后，该协议的几个部分在实际使用中具有特别重要或重要的意义。如实验方案第1节所述，用薄硅胶片组装多孔样品载玻片需要练习。在用盖玻片密封样品时，很容易将泄漏或气泡引入至少一个孔中。孔可以分成多个样品载玻片，以允许使用较小的盖玻片，这将使过程更容易（并且错误成本更低）。虽然这里介绍的测定法可用于表征单个时间点细胞群的运动模式，但这里演示它作为比较单个群体在长时间（超过10小时）的运动模式的工具。与任何长时间延时一样，湿样品的蒸发是不可避免的。通过在成像室中将硅胶垫片牢固地密封到载玻片和盖玻片上，可以最大限度地减少蒸发。如果不这样做，将导致油井相互泄漏或在井内形成气泡。对于不熟悉硅胶垫片使用的研究人员，应将巴氏杀菌泉水或其他清洁介质移液到每个孔中，以便在使用前测试泄漏。样品孔的尺寸都选择用于古 色虫，其大小约为1毫米。这包括硅胶垫片厚度（选择用于将正在研究的 刺槐 细胞限制在二维平面上），直径为5/16“，每孔10个细胞。在将此方案适用于其他细胞类型时，应调整这些数字。
可以调整 TrackCells.m 脚本中的多个参数，以优化自动细胞识别和迹线验证。参数 “最小单元格区域” 和 “最大单元格区域 ”（脚本的第 15 行和第 16 行）允许用户设置单元格的可接受大小范围（以方形像素为单位）。什么值最好取决于实验的许多细节，包括细胞大小，相机像素大小，放大倍率，以及是否存在可能被误认为是细胞的物体，例如气泡。默认值 300 和 1500 对于协议中提供的确切设备和设置是最佳的。优化 “最小单元格区域” 和 “最大单元格区域” 后，调整参数 “阈值 ”（第 17 行）以更改图像对比度。如果设置不正确，单元格轮廓将难以识别或完全丢失，从而妨碍正确的跟踪。如果 “阈值” 的值不能很好地用于正确跟踪，请尝试使用对比度更高或焦点更集中的视频。脚本的第 218 行 bad_trks = find（strk_trks > 20）; 负责丢弃偏离预测运动的痕迹（通过卡尔曼滤波器）太多次。按原样，脚本将 太多 阈值设置为 20。将此整数值减小到 1 以更积极地丢弃跟踪。增加值以降低丢弃的主动性。 TrackCells.m 的大部分内容都是从多对象跟踪教程中采用的，该教程可在 http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html 中自由访问，读者可以参考该教程以获取更多详细信息。补充视频 1-3 是用于脚本测试运行的示例数据视频。
一个多世纪前首次观察到S . coeruleus 完全再生丢失的OA的能力，但关于运动和行为状态的恢复仍然存在许多悬而未决的问题。这里介绍的协议旨在揭开明场成像，自动细胞识别和跟踪以及数据可视化的组合的神秘面纱，作者用于定量表征再生 Stentor群体的运动性。该工作流程广泛适用于一般的运动性研究，并且所包含的脚本和方案可以很容易地用于与具有相似大小和速度的其他生物系统一起工作，例如其他纤毛虫，例如 Paramecium 和 Blepharisma。此外，改变成像室（例如，使用干孔或不同尺寸的孔结合不同的成像放大倍率）极大地扩展了该工作流程的适用性。目前用于 Stentor 的 工具包包括手术解剖、渗透性休克、RNAi、DNA/RNA 分析和小分子抑制剂6.这里提出的量化运动的高通量方法增加了互补性的表征程度，并将用于未来的工作中研究运动表型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了海洋生物实验室惠特曼早期职业奖学金（JYS）的部分支持。我们感谢埃文·伯恩斯、米特·帕特尔、梅兰妮·梅洛和斯凯拉·威德曼帮助进行了一些初步分析和代码测试。我们感谢马克·斯拉博德尼克的讨论和建议。WFM感谢NIH拨款R35 GM130327的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
References
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