Summary
Het artikel introduceert het μTongue (microfluidics-on-a-tongue) apparaat voor functionele smaakcelbeeldvorming in vivo door microfluïdica te integreren in een intravitaal beeldvormingsvenster op de tong.
Abstract
Intravitale fluorescentiemicroscopie is een hulpmiddel dat op grote schaal wordt gebruikt om meercellige dynamica in een levend dier te bestuderen. Het is echter niet met succes gebruikt in het smaaksensorische orgaan. Door microfluïdica te integreren in het intravitale tongbeeldvormingsvenster, biedt de μTongue betrouwbare functionele beelden van smaakcellen in vivo bij gecontroleerde blootstelling aan meerdere smaakstoffen. In dit artikel wordt een gedetailleerde stapsgewijze procedure gepresenteerd om het μTongue-systeem te gebruiken. Er zijn vijf subsecties: voorbereiden van smakelijke oplossingen, opzetten van een microfluïdische module, monstermontage, verkrijgen van functionele beeldgegevens en gegevensanalyse. Enkele tips en technieken om de praktische problemen op te lossen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van de μTongue worden ook gepresenteerd.
Introduction
De intravitale fluorescentiemicroscoop wordt veel gebruikt om de spatiotemporale dynamiek op levende weefsels te bestuderen. Onderzoekers ontwikkelen snel genetisch gecodeerde sensoren die specifieke en gevoelige transformaties van de biologische processen in fluorescentiesignalen bieden - die gemakkelijk kunnen worden geregistreerd met behulp van fluorescentiemicroscopen die op grote schaal beschikbaar zijn1,2. Hoewel de meeste inwendige organen bij knaagdieren zijn onderzocht met behulp van de microscoop, is de succesvolle toepassing ervan op de tong nog niet succesvol geweest3.
Eerdere studies naar de calciumbeeldvorming van smaakcellen werden ex vivo uitgevoerd door een tongweefsel dun te sectien om circumvallaat smaakpapillen te verkrijgen4,5,6 of door het smaakepitheel af te pellen om fungiforme smaakpapillen te verkrijgen7,8. De voorbereiding van deze monsters was onvermijdelijk invasief, dus de natuurlijke micro-omgevingen zoals zenuwinnervatie, permeabiliteitsbarrières en bloedcirculatie werden grotendeels verstoord. Het eerste intravitale tongbeeldvormingsvenster werd in 2015 gerapporteerd door Choi et al., maar betrouwbare functionele opname was niet haalbaar vanwege de beweging en optische artefacten veroorzaakt door fluïde smaakstofstimuli9.
Onlangs werd microfluïdica-op-een-tong (μTongue) geïntroduceerd10. Dit apparaat integreert een microfluïdisch systeem met een beeldvenster op de muizentong. Door gedurende de hele beeldvormingsperiode een quasi-steady-state stroom van smakelijke stimuli te bereiken, konden artefacten van vloeiende bewegingen worden geminimaliseerd(figuur 1). De ingangspoort wordt gevoed door een reeks meerkanaals drukregelaars, terwijl de uitgangspoort is aangesloten op een spuitpomp, die 0,3 ml / min behoudt. Bovendien werden optische artefacten veroorzaakt door het verschil in brekingsindices van smaakoplossingen geminimaliseerd door ratiometrische analyse die een calciumongevoelige indicator (tdTomato) en de calciumindicator (GCaMP6) introduceerde11. Dit ontwerp zorgde voor microscopische stabiliteit van smaakcellen in vivo, zelfs bij abrupt schakelen tussen vloeistofkanalen. Bijgevolg implementeert de μTongue een betrouwbare functionele screening van meerdere smaakstoffen op de smaakpapillen van de muis in vivo.
In dit protocol worden de experimentele procedures in detail uitgelegd voor calciumbeeldvorming van de fungiforme smaakpapillen van muizen in vivo met behulp van μTongue. Eerst wordt de bereiding van kunstmatig speeksel en smakelijke oplossingen beschreven. Ten tweede wordt het opzetten van het microfluïdische systeem geïntroduceerd om de quasi-steady-state flow te bereiken. Ten derde worden de procedures die worden gebruikt om de muizentong op de μTongue te monteren om beeldacquisitie mogelijk te maken, afgebakend. Ten slotte wordt elke stap voor beeldanalyse, inclusief correctie van laterale bewegingsartefacten en ratiometrie, gespecificeerd. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk onderzoekslaboratorium met een muisfaciliteit en een microscoop met twee fotonen of gelijkwaardige apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Sungkyunkwan University en Seoul National University.
1. Bereiding van oplossingen: kunstmatig speeksel en smaakstoffen
- Bereid kunstmatig speeksel door 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4,0,12 mM KH2PO4en 1,8 mM HCl in gedestilleerd water (>1 L) op te lossen en de pH van de oplossing aan te passen aan 7 (zie Materialentabel)12.
- Bereid smaakstoffen, zoals zuur: 10 mM citroenzuur; zout: 400 mM NaCl, optioneel met 50 μM amiloride; zoet: 40 mM acesulfaam K; bitter: een mengsel van 5 mM kinine, 5 mM denatonium en 20 μM cycloheximide, door het oplossen van de smaakstof in het kunstmatige speeksel bereid in stap 1.1.
2. Voorbereiding van het microfluïdische systeem
OPMERKING: Tastanten werden aan de muizentong geleverd met behulp van een meerkanaals vloeistofafgiftesysteem onder druk (zie figuur 1 en tabel met materialen).
- Vul de reservoirs van het onder druk staande stroomperfusiesysteem met het kunstmatige speeksel en de smaakstoffen.
- Sluit de persluchtleiding aan op de ingang van de regelaar en stel de luchtdruk in tussen 30 en 50 psi in het vloeistoftoevoersysteem.
- Stel de uitgangsdruk van de regelaar in op 0,4 psi en controleer of er onder deze druk vloeistof uit de buis komt.
- Sluit het spruitstuk van de reservoirs aan op de ingangspoort van μTongue.
- Sluit de uitgangspoort van μTongue aan op een spuitpomp en zuig vloeistof op met ~ 300 μL ∙ min-1 om de steady-state conditie vast te stellen. Observeer het constante volume van een hangende druppel onder de μTongue. Pas de waarde van de instellingsparameter aan, afhankelijk van de hoogte van het monster.
- Koppel de persluchtleiding los en stop de spuitpomp totdat protocolstap 3 is voltooid.
3. Voorbereiding van muizen op in vivo beeldvorming(figuur 2).
OPMERKING: Alle dierpreparaten werden overdag onder aseptische omstandigheden op een laboratoriumwerkbank uitgevoerd.
- Muis anesthesie
- Bereid een 7 weken oude of oudere muis van beide geslachten voor. Gebruik een genetisch gemodificeerde muizenlijn die calciumgevoelige fluorescentie-eiwitten in de smaakcellen tot expressie brengen.
- De muis wordt in bedwang gehouden voor anesthesie. Een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine wordt intraperitoneaal in de muis geïnjecteerd13.
- TRITC-dextran (500 kDa) in 2,5% W/V fosfaatbuffer zoutoplossing wordt intraveneus toegediend in de muis via een retro-orbitale route om de bloedcirculatie te observeren tijdens een beeldvormingssessie.
- Bevestig een hoofdfixer op de schedel van de muis om bewegingsartefacten te minimaliseren.
- De muiskop wordt besproeid met 70% ETOH terwijl de muis in rugligging wordt geplaatst. Til de kophuid licht op met een tang en knip ongeveer 7 mm2 af met een schaar.
- Reinig het haar rond de hoofdhuid, verwijder het botvlies onder de huid, breng een onmiddellijke lijm aan op de schedel en bevestig een aangepaste hoofdfixer.
- Nadat de instantlijm is uitgehard, breng je tandlijm aan rond de hoofdfixer en verlicht je met een blauw licht om tandlijm te stollen.
- Plaats de muizentong op de onderste eenheid van μTongue.
- Bevestig de onderlip van de muis met een instantlijm aan de onderste eenheid van μTongue.
- Plaats de muis op het bord (muisvoorbereidingsbord in figuur 1B) en plaats de onderste eenheid van de μTongue op de palen (μTongue houd paal in figuur 1B). Zorg ervoor dat de gaten aan de rand van de onderste eenheid zijn uitgelijnd met de paal.
- Draai de muiskopfixer vast aan de hoofdfixerhouder aan het bord. Pas vervolgens de afstand tussen de muiskop en het apparaat aan. Draai de muiskop ongeveer 45° soepel met behulp van de kopfixerhouder. Dit proces voorkomt fysiek contact van de muizenneus met microscoopdoel.
- Teken de muizentong voorzichtig met een plastic pincet en bevestig de ventrale kant van de tong aan de bovenzijde van de onderste eenheid van de μTongue. Veeg vervolgens het oppervlak van de muizentong af met een nat wattenstaafje.
- Week een stuk papier in het kunstmatige speeksel en plaats het op het blootgestelde oppervlak van de muizentong om een natte toestand te behouden.
- Plaats de gebogen ringen op de palen die beide uiteinden van het onderste deel van μTongue vasthouden.
- Plaats de muisvoorbereiding op het microscoopstadium. Plaats de blootgestelde muizentong onder het geschatte midden van het microscoopobject. Zorg ervoor dat u niet afwijkt van het dynamische bereik van het podium. Draai vervolgens het muisbord op het podium vast met schroeven.
- Plaats het verwarmingskussen onder het muisbehang en houd de temperatuur op 36,5 °C-37,5 °C. Bewaak de lichaamstemperatuur van de muis met een temperatuursensor en regel de temperatuur van het verwarmingskussen met behulp van een feedbacksignaal van de temperatuursensor.
- Draai een dun stuk papier en plaats het in de mond van de muis om te voorkomen dat er vloeistof in de luchtpijp van de muis komt.
- Verwijder het natte weefsel van de muizentong en plaats de bereide μTongue op de muizentong. Plaats een microfluïdisch kanaal op de tong en pas de positie aan om het oppervlak van de tong door het beeldvormingsvenster te observeren.
- Zet de μTongue vast door voorzichtig aan beide uiteinden te schroeven met minimale drukdruk.
4. Acquisitie van beeldvorming
- Schakel de 920 nm tweefotonenlaser en de microscoop in voor gebruik.
- Monteer het water-onderdompelingsobject objectief (16x, NA 0,80 of 25x, NA 1.1) op de microscoop. Laat het gedestilleerde water op het beeldvormingsvenster van de μTongue vallen en dompel het objectief onder.
- Schakel in de cameramodus het licht in met de kwiklamp en verlicht het oppervlak van de tong.
- Door de Z-as aan te passen, zoekt u het autofluorescentiesignaal van de filiforme papillen om het geschatte brandpuntsvlak te vinden. Zoek vervolgens met behulp van de X- en Y-instelknop een smaakpapillen.
- Schakel over naar de multifoton-modus. Stel de beeldacquisitievoorwaarden als volgt in: excitatiegolflengte: 920 nm; emissiespelset: 447/60 nm, 525/50 nm en 607/70 nm; bidirectionele rasterscanmodus, framegrootte: 512 x 512.
- Pas de X- en Y-posities aan om de smaakpapillen in het midden van het afbeeldingsvenster te plaatsen.
- Doorzoek de bloedvaten rond de smaakpapillen op ongeveer tweederde hoogte van de smaakpapillen. Visualiseer de bloedcirculatie door TRITC-dextran (500 kDa) injectie uit protocol stap 3.2. Als de bloedstroom verstopt, maak dan de bevestigingsschroeven iets los om de bloedstroom mogelijk te maken.
- Pas de Z-as aan en zoek het Z-vlak van smaakpapillen dat een voldoende aantal smaakcellen bevat.
- Ga verder met calciumbeeldvorming met 2-6 Hz gedurende 80 s. Zorg voor een smaakoplossing van 20 s door het reservoir van het vloeistofsysteem in te schakelen nadat de beeldvorming is gestart. Schakel na 20 s smaakstimulatie het reservoir terug naar kunstmatig speeksel.
- Nadat de sequentiële beeldvorming is voltooid, wacht u ongeveer 3-4 minuten van tevoren tot de volgende beeldvormingssessie. Houd het kunstmatige speeksel naar de muizentong om het smakelijke remanent van de vorige beeldvormingssessie weg te spoelen. Afhankelijk van het ontwerp van het experiment herhaalt u de sessie indien nodig.
- Wanneer in vivo calciumbeeldvorming is voltooid, euthanaseer de muis volgens de IACUC-procedure. De muis onder narcose wordt opgeofferd in de CO2-kamer.
OPMERKING: Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van een teen-knijpreflex. Tijdens een beeldvormingssessie moet kunstmatig speeksel uit de reservoirs consequent worden verstrekt. Als er bellen verschijnen in het beeldvormingsvenster van de μTongue, verwijder dan de bellen door ze met een sterke vloeistofdruk door de ingang of de uitgang van de μTongue te duwen.
5. Beeldanalyse (Figuur 3)
- Beeldconversie
- Open de RAW-afbeeldingsbestanden met Fiji14 of een vergelijkbare beeldanalysesoftware.
- Converteer het afbeeldingsbestand naar een RGB-stackbestand om de NPL Bud Analyzer-code te gebruiken.
- Afbeelding > kleur > gesplitste kanalen
- Afbeelding > Kleur > samenvoegen en selecteer de afbeelding in stap 5.2.1.
- Afbeelding > kleur > stack naar RGB
- Beeldregistratie
OPMERKING: Gebruik de op maat geschreven code voor gegevensanalyse. Zie https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Voer de codenaam Taste_GUI.muit; er verschijnt een GUI-venster met de naam NPL Bud Analyzer. Klik op de knop Nieuwe analyse in de rechterbovenhoek en laad vervolgens de geconverteerde afbeelding uit stap 5.1. Stel de framesnelheid in boven de geladen afbeelding.
- Teken het interessegebied (ROI) over de geladen afbeelding voor registratie. Dubbelklik op de geselecteerde ROI en er wordt een automatisch berekende registratie gestart.
- Verkrijg de relatieve fluorescentie-intensiteitsveranderingen (ΔF/F)
- Ga terug naar het venster NPL Bud Analyzer om de geregistreerde afbeelding uit stap 5.2 automatisch weer te geven. Als de gebruiker al een reg-bestand heeft, klikt u op de knop Gegevens laden en selecteert u het _reg.tif bestand.
- Klik op de knop CIRKEL of POLYGOON en plaats de ROI van de smaakcel over de afbeelding van de smaakpapillen.
- Dit presenteert de ruwe fluorescentie-intensiteit en het calciumspoor (ΔF/F) van de geselecteerde smaakcel automatisch onder het smaakpapillenbeeld.
- Klik op Trace opslaan om het calciumspoor (ΔF/F) aan de rechterkant van de GUI te presenteren, terwijl de ROI wordt weergegeven over de afbeelding van de smaakpapillen. Herhaal stap 5.3.2-5.3.4 totdat de ROI-selectie is voltooid.
OPMERKING: Klik op de knop Traceren verwijderen als de ROI verkeerd is geselecteerd om de laatst geselecteerde ROI en calciumtracering te elimineren. - Nadat de ROI-selectie is voltooid, schrijft u de bestandsnaam in de rechterbenedenhoek en klikt u op de knop Voltooien om het ΔF/ F-calciumtraceer als een .xls-indeling en de tase bud-afbeelding met ROI's in een .bmp-indeling te exporteren.
- Analyse van het calciumspoor
- Analyseer het calciumspoor verkregen uit stap 5.3. Bedenk dat smaakcellen hebben gereageerd op tastant wanneer de fluorescentie-intensiteit meer dan twee standaardafwijkingen van de uitgangswaarde stijgt nadat het smaakstof is afgeleverd4, en p-waarden zijn minder dan 0,01, met behulp van gepaarde of ongepaarde t-tests10.
- Beschouw de smaakcel als een respondercel, als deze meer dan twee van de drie onderzoeken (~ 60%) op een bepaald smaakstof reageert15.
- Verkrijg de representatieve calciumsporen door het gemiddelde te nemen van individuele calciumsporen verkregen uit stap 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis werd gebruikt om een smaakpapillenbeeld te verkrijgen. Het oppervlak van de muizentong was bedekt met autofluorescente filiforme papillen. Smaakpapillen worden schaars verspreid over het oppervlak van de tong(figuur 4A). De beelden van de smaakpapillen en zijn structuur werden verkregen met behulp van drie verschillende filterdetectoren. Met behulp van de 607/70 nm filterset werd het tdTomato signaal van de smaakcellen verkregen voor ratiometrische analyse(Figuur 4B). Met behulp van de 525/50 nm filterset werd het GCaMP-signaal verkregen van de smaakcellen en bloedvaten die de smaakpapillen omringen(figuur 4B). Met behulp van de 447/60 nm filterset werd het collageen bindweefsel, dat de smaakpapillen structureel ondersteunt, verworven(Figuur 4B).
Na het verkrijgen van de beelden van de smaakpapillen en relatieve structuren, werd in vivo calciumbeeldvorming uitgevoerd met behulp van het protocol. De Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis werd gebruikt om te screenen op smaakcellen (Figuur 5A)16. Smaakcellen reageerden herhaaldelijk op hun respectievelijke smaakprikkels (figuur 5B). Smaakcellen werden geacht op de smaakstof te hebben gereageerd wanneer ze voldeden aan de voorwaarden in protocol 5.1.4. In deze proef reageerde cel 2 op zowel zoete als umami-smaakstoffen. Het resultaat is consistent met eerder onderzoek naar cellulaire activiteit met behulp van elektrofysiologie17. Cel 3 reageerde op zowel 400 mM NaCl als 400 mM NaCl onder amiloride. Het impliceert dat cel 3 een ENaC-onafhankelijke route heeft gebruikt voor de reactie op zoute smaak. De smaakpapillen in dit experiment bevatten geen cel die reageert op zure smaken. De screening van smaakcellen werd uitgevoerd onder stabiele beeldvormingsomstandigheden en elke smaakcel vertoonde een herhaalbare reactie op een ander type smaak.
Figuur 1: De μTongue, een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform. (A) Onder druk gezet vloeistofafgiftesysteem. i) De drukregelaar van het vloeistofsysteem is aangesloten op de externe luchtbron. De druk van de luchtbron wordt aangepast tussen 30-50 psi voordat de drukregelaar wordt betreden. (ii) De luchtdruk van de regelaar is ongeveer 0,4 psi. iii) Reservoirs die kunstmatig speeksel en verschillende smaakoplossingen bevatten, zijn verbonden met de uitgang van de luchtdrukregelaar. iv) Elk reservoir convergeert naar een variëteit die is aangesloten op de ingangspoort van de μTongue. v) Een spuitpomp is aangesloten op de uitgang van de μTongue en regelt de stroom. (B) De μTongue, een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform. De naam van elk onderdeel is gespecificeerd in de figuur. i) Voorbereidingsbord voor muizen. (ii) Fluidic system setup board. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Sequentiële beschrijving van de voorbereiding van muizen. Belangrijke stappen in de muisvoorbereiding worden getoond. A)Retro-orbitale injectie van TRITC-dextran. (B) Proces van bevestiging van een hoofd fixer aan de muis schedel wordt getoond. De hoofdhuid en het periosteum worden gezuiverd. Lijm en tandlijm worden gebruikt voor bevestiging. (C) De hoofdfixer op de muizenschedel wordt op het muisvoorbereidingsbord geschroefd. D)Procedure voor het monteren van een tong op de onderste eenheid van de μTongue. Een instant lijm wordt gebruikt voor tongfixatie. De tong wordt gereinigd met een nat wattenstaafje en bedekt met natte papieren zakdoekjes om uitdroging te voorkomen. (E) Gebogen ringen worden aangebracht op beide uiteinden van de onderste eenheid van de μTongue. (F) Een stuk gedraaid papieren zakdoekje wordt in de mondholte van de muis geplaatst. (G)Muisvoorbereidingskaart is gemonteerd op de microscooptrap en stevig geschroefd om stabiele beeldvormingsomstandigheden te garanderen. (H) De μTongue wordt op de tong geplaatst. Een objectieflens wordt over het beeldvenster afgesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afbeeldingsanalyse. (A) Van elke afbeelding met één kleur wordt een RGB-afbeelding geconverteerd. Schaalbalk, 10 μm. (B) Afbeeldingsregistratie met behulp van een uitgevoerde aangepaste code. (C) GUI van de aangepaste code. (i) Invoerlocatie voor de framesnelheid. De standaard framesnelheid is 0,16 s/frame. (ii) Knoppen om ROIs te tekenen. (iii) Het gebied waarin de geladen afbeelding wordt weergegeven. (iv) Het calciumsignaal van de geselecteerde ROI wordt weergegeven als een groen spoor, terwijl het calciumongevoelige signaal van de geselecteerde ROI wordt weergegeven als een rood spoor. (v) Ratiometrische analyse en ΔF/F worden automatisch berekend. De ΔF/F grafiek wordt weergegeven in magenta. (vi) Knoppen voor het laden van afbeeldingen. Nieuwe analyse is voor het laden van een RGB-geconverteerde afbeelding. Load Data is voor het laden van een afbeelding die al is geregistreerd. (vii) De knop Traceren opslaan is bedoeld om de grafiek ΔF/F en de ROI geselecteerd te houden op viii. De knop Traceren verwijderen is om de grafiek ΔF/F uit viii te verwijderen. (viii) Opgeslagen calciumsporen worden getoond. (ix) Gebied om de bestandsnaam in te vullen. De knop Voltooien is om gegevens te extraheren en op te slaan in dezelfde map van de code. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het oppervlak van de muizentong en een smaakpapillen in de schimmelvormige papillen. (A) Het oppervlak van de muizentong wordt gevangen in een groot veld. Een smaakpapillen verhoornde filiforme papillen en de collageenstructuur worden getoond. Elke structuur wordt aangegeven met verschillende kleuren: respectievelijk magenta, geel en groen. Schaalbalk, 100 μm. (B) Een smaakpapillen van (A) wordt vergroot en vastgelegd met behulp van drie verschillende emissiefilterdetectoren. De filiforme papillen, in geel, worden vastgelegd met behulp van een 525/50 nm detector. Deze structuur wordt waargenomen vanaf het oppervlak van de tong tot ~ 25 μm diep. GCaMP-signalen in groen en tdTomato-signalen in rood vertegenwoordigen de smaakcellen. Deze signalen worden gedetecteerd door respectievelijk 525/50 en 607/70 nm detectoren. Rhodamine dextran die de bloedcirculatie vertegenwoordigt, wordt opgevangen bij zowel 525/50 als 607/70 nm detectoren. De collageenstructuur in cyaanblauw wordt verkregen door detectoren van 447/60 nm. De laatste foto toont alle voorgaande afbeeldingen samengevoegd. Schaalbalk, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Smaakscreening van een Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis in vivo. (A) Een representatieve smaakpapillen van de Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis. De afbeelding wordt weergegeven als een op intensiteit gebaseerde pseudo-kleur. Stippellijnen bakenen elke smaakcel af. De helderheid van elke smaakcel hangt af van de expressie van het fluorescerende eiwit en de diepte van de locatie van de smaakcel. Schaalreep, 10 μm. (B) Het calciumspoor van elke smaakcel voor de vijf basissmaakprikkels. Elke herhaalde proef wordt in grijs op de achterkant weergegeven en het gemiddelde spoor wordt boven elke proef weergegeven. Gekleurde sporen worden gedefinieerd als responsief, terwijl zwarte sporen worden gedefinieerd als niet-responsief. Elke kleur vertegenwoordigt een andere smaak. Zout (L) vertegenwoordigt laag zout, met een mengsel van 400 mM NaCl en 50 μM amiloride gebruikt voor smaakstimulatie. Salty (H) vertegenwoordigt hoog zout, met 400 mM NaCl gebruikt voor stimulatie. Smaakstimulatie wordt weergegeven als een grijze doos op de achterkant van elk calciumspoor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om μTongue toe te passen op het onderzoek naar functionele activiteiten van smaakcellen in vivo. In dit protocol wordt de functionele beeldvorming op de smaakcellen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgevoerd. Naast het gebruik van transgene muizen kan de elektroforetische belasting van calciumkleurstoffen (of spanningsgevoelige kleurstoffen) op de smaakcellen een alternatieve optie zijn.
Alle smaakoplossingen van minder dan 1,336 brekingsindex werden in dit experiment gebruikt. Hoewel μTongue een stabiele vloeibare afgifte biedt en de ratiometrische analyse beeldvormingsartefacten verbetert, zal het voor de onderzoekers een uitdaging zijn om een hogere concentratie tastant te gebruiken (bijvoorbeeld >100 mM sucrose met brekingsindex in 1,338). Het grote verschil in brekingsindex tussen kunstmatig speeksel en smaakoplossing verschuift het beeldfocusvlak meer dan het compensatiebereik door het post-image proces. Empirisch wordt een bepaald bereik van brekingsindex van smaakoplossing (minder dan 1,336) verkregen dat stabiele cellulaire beeldvorming in realtime mogelijk maakt.
Voor onderzoekers die ervaring hebben met fluorescentiebeeldvorming en dierbehandeling, kan dit protocol gemakkelijk worden geleerd via herhaalde oefening. Het bevat echter kritieke stappen, die vaak een succesvolle data-acquisitie belemmeren. Ten eerste, eenmaal uitwendigd van de orale beleefdheid, moet de tong vochtig worden gehouden met kunstmatig speeksel om de natuurlijke mucosale micro-omgeving te behouden. Ten tweede moet de bloedcirculatie rond de smaakpapillen intact zijn, om een fysiologische toevoer van zuurstof, voedingsstoffen en door bloed overgedragen factoren te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen: J. Han en M. Choi zijn uitvinders van de gepatenteerde μTongue-technologie die in dit artikel wordt beschreven, en het μTongue-systeem is commercieel verkrijgbaar via SciTech Korea.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789), en door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3E5D2A01058329). We zijn Eunsoo Kim en Eugene Lee dankbaar voor hun technische assistentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
