Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll, med tips för att generera xenografter och riktlinjer för tumörbeteendeanalys, helmonterad immunofluorescens och konfokal avbildnings kvantifiering.
Zebrafisk larval xenografts används ofta för cancerforskning för att utföra in vivo- och realtidsstudier av mänsklig cancer. Möjligheten att snabbt visualisera svaret på anti-cancer terapier (kemoterapi, strålbehandling och biologiska läkemedel), angiogenes och metastasering med encellig upplösning, placerar zebrafish xenograft modell som ett toppval för att utveckla prekliniska studier.
Zebrafisk larv xenograft analys presenterar flera experimentella fördelar jämfört med andra modeller, men förmodligen den mest slående är minskningen av storlek skala och följaktligen tid. Denna minskning av skalan möjliggör encellig avbildning, användningen av ett relativt lågt antal mänskliga celler (kompatibla med tarmbiopsier), medium-high-throughput läkemedelsscreening, men viktigast av allt möjliggör en betydande minskning av tiden för analysen. Alla dessa fördelar gör zebrafisk xenograft-analysen extremt attraktiv för framtida personliga medicinska applikationer.
Många zebrafish xenograft protokoll har utvecklats med en stor mångfald av mänskliga tumörer; emellertid saknas fortfarande ett allmänt och standardiserat protokoll för att effektivt generera zebrafisk larv xenografts. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll, med tips för att generera xenografter och riktlinjer för tumörbeteendeanalys, helmonterad immunofluorescens och konfokal avbildnings kvantifiering.
Zebrafisk (Danio rerio) växer fram som en kraftfull ryggradsdjur modell organism för att studera utveckling och sjukdom. Zebrafisk delar mycket bevarad genetisk (~ 70% genetisk homologi och ~ 84% sjukdomsrelaterade gener) och grundläggande organmorfologiska egenskaper med människor1,2. Denna bevarande gör det möjligt att använda zebrafisk för att modellera flera mänskliga sjukdomar, inklusive cancer3,4.
Hantering och underhåll av zebrafisk är mycket enklare och mer kostnadseffektivt än möss på grund av deras lilla storlek, höga fecundity året runt och extern befruktning3,5. Zebrafiskembryon kräver inte levande utfodring under sina första 5-7 dagar i livet och har använts som en effektiv modell för utveckling, infektion och cancer1,4,6,7. Zebrafiskembryon kläcks vid 48 timmar efter befruktning (hpf) och är fritt simmande djur med alla organ bildade, ett bultande hjärta och funktionellt cirkulationssystem, lever, hjärna, njurmärg etc.1,3. I detta utvecklingsstadium är det också endast medfödd immunitet som är i spel, adaptiv immunitet utvecklas fortfarande, vilket möjliggör en allmän effektiv engraftment av mänskliga celler utan behov av användning av immunkomprometterade mutanter7,8. Det är dock viktigt att notera att inte alla mänskliga celler insuperlika 9 och att det till exempel för leukemiceller visades att fagocyter (neutrofiler och makrofager) måste tömmas för effektiv engraftment10.
Zebrafiskens genetiska dragbarhet och den optiska öppenheten i dess tidiga embryonala stadier möjliggör intravital avbildning med en enda cell med hög upplösning och därmed för inrättandet av toppmoderna bildframställningstekniker inom olika biologiområden. Dessutom, i samband med cancer, är dessa funktioner användbara för realtidsstudier av de tidigaste stadierna av värdtumörinteraktioner, som att studera angiogen och metastaserad potential, liksom interaktioner med det medfödda immunsystemet8,9,11,12,13.
Även om det i den korta xenograftanalysen inte finns tid för metastaserad “evolution”- är det möjligt att analysera tumörcellernas metastaserade kapacitet (dvs. deras effektivitet att gå igenom metastaserade steg som invasion, intravasation, överlevnad i cirkulation, extravasation och kolonisering, och därför studera dessa processer in vivo och i realtid8,11,13,14).
Egenskaperna hos dess livscykel placerar zebrafisken som en unik modell för personlig medicin vid cancer. Analyser kan utföras på kortare tid och resultat som erhållits om några veckor7,8,9,11,12,15,16. Celerity och genomförbarheten av dessa analyser ger läkare och forskare möjlighet att få översättningsresultat som kan vara användbara för cancerpatienter, för vilka tid är ett viktigt behov.
Trots de ökande försöken att generera framgångsrika zebrafisk embryo xenografts, Det finns fortfarande ett behov av standardisering av injektion förfarandet samt utvärdering av cell livskraft och tumör beteende efter injektion.
I detta protokoll ger vi forskare en tydlig och detaljerad steg-för-steg-guide för injektion av mänskliga cancercelllinjer i zebrafiskembryon och efterföljande fixering, immunostaining, avbildning och kvantifiering av tumörcellsbeteende.
Zebrafiskens ökande betydelse som modell för cancerutveckling och läkemedelsscreening har resulterat i många publikationer3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Injektionen av cancerceller i zebrafiskembryon är dock en teknik som kräver en hög fingerfärdighet som kan vara utmanande för forskare. I detta protokoll strävar vi efter att ge praktisk information och några tips som kan hjälpa till att övervinna de första utmaningarna med att sätta upp zebrafiskembryon xenografts.
Cellhantering före injektion
Detta optimerade protokoll för generering av zebrafisk xenografter med cellinjer kan anpassas till olika typer av (cancer) celler med olika morfologier. Vi rekommenderar att alla cellinjer som används för zebrafisk xenografts är mykoplasmafria. Till skillnad från andra bakteriella föroreningar genererar närvaron av mykoplasma i cellkulturen inte förändringar som lätt kan detekteras under mikroskopet22. Mykoplasmaförorening kan påverka celllinjernas engraftmentpotential, deras känslighet för droger samt zebrafiskembryons livskraft.
Även om celler kan fortsätta att föröka sig under en längre period, kan deras fenotyp och genotyp vara benägna att förändringar. Det är viktigt att bekanta sig med celllinjernas morfologi och beteende i kulturen. Vi rekommenderar att du behåller antalet cellpassager efter upptining mellan 3-12 för att få reproducerbara resultat. Således bör regelbundna mykoplasmatester utföras.
Cellerna bör vara i sin loggfas (exponentiell tillväxtfas innan de når sammanflöde ~70%) på injektionsdagen. Detta kommer att möjliggöra en adekvat engraftment och korrekt utveckling av de särskiljande kännetecknen för tumör. För att förhindra variation i fenotypen av celler inom xenograften är det viktigt att upprätthålla sammanflödet för injektionskonstant mellan experiment. Antalet injicerade celler kan anpassas till egenskaperna hos varje cellinje eftersom vissa kan kräva högre täthet av injektion för att trivas i zebrafiskembryon.
Överväganden om cellmärkning
För att bättre visualisera mänskliga tumörceller för injektion och framtida analys kan tumörceller märkas med fluorescerande färgämnen. På grund av skillnader i cellstorlek varierar det totala antalet celler/cm2 i vidhäftande kulturer mellan cellinjer. Detta kommer att påverka färgningsprotokollets effektivitet samt antalet celler som skördas för injektion. Stora celler som ger låga tal per kolv (dvs. Hs578T) eller växer i kluster (dvs. BFTC905) kommer att kräva sammanslagning av flera flaskor för ett enda experiment. I detta fall bör färgningen av celler inte utföras direkt i kolven eftersom detta kommer att orsaka användning av alltför stora mängder färgämne (hög kostnad). Å andra sidan kan celler som är mycket känsliga för alltför stora centrifugeringscykler samt celler som ger ett högt antal per kolv (dvs. HCT116) färgas direkt i kolven och sedan lossas med EDTA/cellskrapa (För mer information se tabell 1).
När det är möjligt, i stället för att använda ett enzymatiskt tillvägagångssätt, använd EDTA för att lossa cellerna på injektionsdagen, så att cellerna återhämtar sina cellcellskorsningar snabbare och utsätts för mindre centrifugeringssteg. Men om cellerna är känsliga för EDTA, mycket vidhäftande eller växer i kluster – kan en enzymatisk metod tillämpas. Optimeringen av den idealiska koncentrationen för injektion samt injektionsmediet är beroende av egenskaperna hos varje cellinje, vilket kan behöva vissa justeringar (tabell 1).
Kalibrering av mikroinjektion
I motsats till leverans av oligonukleotider eller läkemedel till zebrafiskembryon används inte en gratikule för att kalibrera nålen när man arbetar med cellinjer för xenografter. Efter en tid under injektionen börjar cellerna täppa till, och det är nödvändigt att skära nålens spets för att öka dess diameter eller byta nålen helt och hållet. Denna procedur hindrar graticulekalibreringen.
För att ta itu med denna fråga regleras antalet celler som dispenseras av utmatningstryck och tid som behövs för att nå en storlek som liknar embryoögat inom 1-3 pulser. För att ytterligare kontrollera tumörstorleken, vid 1 dpi, sorteras xenografter efter tumörstorleken som visas i figur 6 B-B”. Som representeras i figur 6C-exempel är denna sorteringsmetod effektiv för att minska variationen av tumörstorlekar: om vi slår samman dem alla (+, ++, +++) är STEV ~dubbelt så stor som ++-klassen (~906 celler till ~422 celler) och koefficientvariationen är ~31,9% jämfört med 14,5% i ++-klassen. Eftersom referensen för injektion är volym varierar det totala antalet celler mycket mellan celltyper – beroende på cellernas storlek och form. Till exempel producerar stora celler med mycket cytoplasma som bröstcancer Hs578T, mycket mindre tumörer (~ 600 celler). Dessutom kräver varje cellinje olika antal celler. Till exempel har HT29 CRC och RT112 urinblåsan cancer cellinjer visat att ju högre antalet celler injiceras, desto högre är zebrafiskdödligheten. Därför behövs en optimeringsperiod vid utveckling av xenografterna för att testa om cellinjen har toxiska effekter i embryot eller kräver högre/lägre densiteter av injektion.
Injektionsställe
En av de vanligaste skillnaderna vid generering av zebrafiskembryon xenografter är injektionsstället. Äggulan är vanligtvis platsen för injektion på grund av dess enkla tillgänglighet. Vi har dock observerat att celler som injiceras i äggulan har en högre tendens att dö. Även om det är tekniskt svårare rekommenderar vi att du injicerar i PVS och så långt som möjligt från hjärtat. Inom PVS kan celler aggregera, rekrytera kärl och immunceller och migrera, intravasat, extravasat och bilda mikrometastas, om de visar metastaseradeegenskaper 8,11.
Engraftment effektivitet
Skillnader i engraftment effektivitet och tumör storlek bland cellinjer vid 4 dpi förväntas på grund av deras distinkta grader av basal cell död /överlevnad/spridning men också på grund av den medfödda immunogenicitet som varje cellinje kan visa9.
metastas
Metastasering består av en multistep kaskad av händelser som kan delas in i två godtyckliga stadier. I det första skedet måste tumörceller lossna från den primära platsen, migrera och invadera intilliggande vävnader och sedan intravasera in i blodomloppet. I det andra steget måste tumörceller överleva i omlopp, extravasera från blodet eller lymfkärlen och slutligen kolonisera på sekundära platser23. För att skilja mellan dessa tidiga och sena händelser och ta itu med potentialen/färdigheterna hos de olika tumörcellerna för att utföra dessa steg, utformade vi en enkel analys.
I allmänhet, när injiceras i PVS, tumörceller kan komma in direkt i omlopp och sedan bli fysiskt fångade i caudal hematopoietic vävnad (CHT) (svans regionen). Men enligt egenskaperna hos varje tumörcell – vi har sett att vissa tumörceller förblir vid CHT 4 dpi och kan bilda mikrometastas medan andra tumörceller försvinner (rensas efter att ha fastnat i CHT).
Genom att jämföra mikrometastasens effektivitet (vid 4 dpi) när celler placerades direkt i omlopp – CIRC (celler behöver bara gå igenom de sena stegen av metastasering) jämfört med när inte – INGEN CIRC (celler måste gå igenom tidiga och sena steg för att kunna bilda en mikrometastas) kan vi bedöma deras tidiga eller sena metastaseringspotential. Vi har observerat tumörceller som effektivt kan bilda mikrometastas i CHT i båda grupperna (CIRC och NO CIRC), vilket tyder på att dessa celler har kapacitet att genomgå alla steg i den metastaserade kaskaden (SW480 och MDA-MB-468 till exempel)8,11. Däremot har andra tumörceller en mycket låg metastaserad potential i båda grupperna, vilket nästan aldrig gör mikrometastas, även när de injiceras i omlopp (dvs. synliga i CHT vid 24 hpi, men vid 4 dpi är de inte längre där, Hs578T tillexempel) 8. Vi har dock tydligt hittat en annan grupp – en som bara kan bilda mikrometastas när den injiceras i omlopp (vi kan bara observera mikrometastas i CIRC-gruppen). Detta tyder på att dessa celler har en låg effektivitet när det gäller att utföra de första stegen i den metastaserade kaskaden men å andra sidan kan överleva i omlopp, extravasera och kolonisera en avlägsen plats.
Immunostaining och avbildning
Före fixering kan detta injektionsprotokoll användas för andra live-avbildningsmetoder som DIC-mikroskopi (Live Differential Interference Contrast), snurrande diskmikroskopi, högupplöst levande konfokal avbildning och ljusplåtmikroskopi etc.
Döda celler och cellulära skräp verkar ljusa när de observeras genom det fluorescerande stereomikroskopet och kan misstas för levande celler, särskilt om syftet med studien är att bedöma celllinjernas metastaserade potential. Vi vill betona vikten av att utföra konfokal avbildning med specifika livskraftsmarkörer och DAPI för att bedöma överlevnadstillståndet för tumör och mikrometastas. Det är också grundläggande att använda specifika mänskliga antikroppar för att upptäcka mänskliga celler som anti-mänskliga mitokondrier eller anti-human HLA. När protokollet implementeras tränar du experimentörögon genom att jämföra färgningen i stereomikroskopet med de konfokala bilderna. Efter en tid kan experimenterare tydligt skilja skräp från levande celler i det fluorescerande stereomikroskopet.
Även om andra metoder för att kvantifiera tumör börda såsom hela fluorescens område används i stor utsträckning, rekommenderar vi att utföra hela mount immunostaining och confocal imaging som en mer exakt metod. Inte bara effektiviteten av lipofila färgfärgning är mycket varierande (dvs. vissa celler är mycket väl färgade medan andra inte – förmodligen på grund av lipidinnehållet i deras membran), men också många gånger lipofila färgämnen bildar aggregat, och döda celler tenderar att vara ljusare – vilket skapar flera artefakter som kan misstas för levande celler.
Celler kan transducera med fluorescerande proteiner för att underlätta spårning och hoppa över cellmärkning. Se dock till att de transduced och icke-transduced cellerna producerar samma resultat i zebrafish xenografts.
Dessutom kan makrofager fagocyter dessa fluorescerande cellrester blir fluorescerande märkta och migrera, vilket genererar falska positiva ögonbevarande celler. Således rekommenderar vi en serie analysverktyg, som naturligtvis kan utökas till många andra avläsningar för en mer exakt tolkning av tumörbeteende:
För ett konfokalt förvärv med 5 μm intervall mellan skivor i Z-stacken av kontrollcancercellerna HCT116 (genomsnittlig nukleär storlek på 10-12 μm diameter) med DAPI-motstning, har vi observerat att ~ 50% av cellerna delas mellan två på varandra följande skivor. Därför, om varje segment räknas, finns det en hög risk att räkna samma celler två gånger. Att gå fram och tillbaka mellan segment för att undvika problem med kvantifiering resulterar i en tidskrävande och felbenägen teknik. För att underlätta kvantifieringen av det totala antalet celler och möjliggöra mer reproducerbarhet mellan forskare skapade vi tumörstorleksformeln som tidigare beskrivits i detta protokoll8.
Vi inkluderade ett korrigeringsnummer (1,5) för att ta hänsyn till de ~50% celler som delas mellan segment. Vi fann att det genomsnittliga felet med manuell räkning av hela tumören mellan forskare var 20%. Två forskare som använde formeln hade ett 2% fel. Användningen av denna formel har en noggrannhet på 93% och 98% reproducerbarhetsgrad. Vi testade också automatiserade metoder, men de visade ett fel som var högre än 50% orsakat av tröskelvärden.
På grund av egenskaperna hos apoptotiska celler är kvantifieringen av aktiverade Caspase 3-celler svårare. För att minska antalet misstag och variationer i resultat rekommenderar vi att kontroll- och experimentella prover räknas av samma forskare. När man lär sig denna teknik måste en ny forskare dessutom räkna bilder som redan kvantifierats av mer erfarna forskare för att jämföra resultat och träna.
Analysens längd kan förlängas vid behov. Det är dock viktigt att tänka på att zebrafisklarver kräver levande utfodring från ~ 7 dagar efter befruktning (5 dagar efter injektion). Dessutom kan djurskyddsriktlinjerna och reglerna som tillämpas på larver äldre än 6 dagar efter befruktning variera.
Detta protokoll ger användbara verktyg för att göra det möjligt för en enda forskare att injicera cirka ~ 200-300 zebrafisklarver per timme; och resultat för den fullständiga analysen, inklusive analys och statistisk tolkning, som erhållits om tre veckor. Vi hoppas att detta protokoll kan hjälpa forskare att bli experter på att generera zebrafisk xenografts. Det är inte lätt; Du måste öva, men du kommer dit. Lycka till!
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medfinansierat av FCT/Lisboa2020) för finansiering. FCT-stipendier för VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alla medlemmar i Fior Lab för kritiska diskussioner; B. Costa och C. Rebelo de Almeida för att dela data; och våra labmedlemmar C. Rebelo de Almeida, M. Barroso och L. Leite för deras deltagande i videon. Vi vill tacka CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) och Champalimaud Communication, Events and Outreach team i synnerhet Alexandre Azinheira för det fantastiska filmskapandet och Catarina Ramos och Teresa Fernandes för deras hjälp.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |