Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.
Xenoenxertos larval de zebrafish estão sendo amplamente utilizados para pesquisas sobre câncer para realizar estudos in vivo e em tempo real do câncer humano. A possibilidade de visualizar rapidamente a resposta às terapias anticâncgenas (quimioterapia, radioterapia e biológica), angiogênese e metástase com resolução celular única, coloca o modelo de xenoenxerto de zebrafish como uma das principais escolhas para desenvolver estudos pré-clínicos.
O ensaio larval de xenoenxerto de zebrafish apresenta várias vantagens experimentais em comparação com outros modelos, mas provavelmente o mais marcante é a redução da escala de tamanho e, consequentemente, do tempo. Essa redução de escala permite imagens de células únicas, o uso de um número relativamente baixo de células humanas (compatível com biópsias), triagens de medicamentos de alto rendimento, mas o mais importante permite uma redução significativa do tempo do ensaio. Todas essas vantagens tornam o ensaio de xenoenxerto de zebrafish extremamente atraente para futuras aplicações de medicamentos personalizados.
Muitos protocolos de xenoenxerto de zebrafish foram desenvolvidos com uma ampla diversidade de tumores humanos; no entanto, ainda falta um protocolo geral e padronizado para gerar xenoenxertos larval de zebrafish. Aqui fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.
O zebrafish (Danio rerio) está emergindo como um poderoso organismo modelo vertebrado para estudar o desenvolvimento e a doença. O zebrafish compartilha características genéticas altamente conservadas (~70% de homologia genética e ~84% de genes relacionados à doença) e características morfológicas básicas de órgãos com humanos1,2. Essa conservação permite o uso de zebrafish para modelar várias doenças humanas, incluindo o câncer3,4.
O manuseio e manutenção de zebrafish é muito mais fácil e econômico do que os camundongos devido ao seu pequeno tamanho, alta fecundidade durante todo o ano e fertilização externa3,5. Os embriões de zebrafish não necessitam de alimentação viva durante seus primeiros 5-7 dias de vida e têm sido usados como um modelo eficaz para o desenvolvimento, infecção e câncer1,4,6,7. Os embriões de zebrafish chocam a 48 horas após a fertilização (hpf) e são animais de natação livre com todos os órgãos formados, um sistema circulatório pulsante e funcional, fígado, cérebro, medula renal, etc.1,3. Além disso, nesta fase de desenvolvimento apenas a imunidade inata está em jogo, a imunidade adaptativa ainda está em desenvolvimento, permitindo um enxerto eficiente geral de células humanas sem necessidade de uso de mutantes imunocomprometidos7,8. No entanto, é importante notar que nem todas as células humanas engrafam igualmente9 e que, por exemplo, para as células de leucemia foi demonstrado que os fagocitos (neutrófilos e macrófagos) precisam ser esgotados para um enxerto eficiente10.
A trato genética dos zebrafish e a transparência óptica de seus estágios embrionários iniciais permitem imagens intravitais de célula única em alta resolução e, portanto, para o estabelecimento de técnicas de imagem de última geração em diversos campos da biologia. Além disso, no contexto do câncer, essas características são úteis para estudos em tempo real dos estágios iniciais das interações hospedeira-tumor, como o estudo do potencial angiogênico e metastático, bem como interações com o sistema imunológico inato8,9,11,12,13.
Embora no curto ensaio xenoenxerto não haja tempo para “evolução” metastática- é possível analisar a capacidade metastática das células tumorais (ou seja, sua eficiência para passar por etapas metastáticas como invasão, intravasão, sobrevivência em circulação, extravasão e colonização, e, portanto, estudar esses processos in vivo e em tempo real8,11,13,14).
As características de seu ciclo de vida colocam o zebrafish como um modelo único para a medicina personalizada no câncer. Os ensaios podem ser realizados em um período de tempo mais curto e os resultados obtidos em poucas semanas7,8,9,11,12,15,16. A celeridade e a viabilidade desses ensaios proporcionam aos médicos e pesquisadores a possibilidade de obter resultados translacionais que possam ser úteis para pacientes com câncer, para os quais o tempo é uma necessidade essencial.
Apesar das tentativas crescentes de gerar xenoenxertos de embrião de zebrafish bem sucedidos, ainda há necessidade da padronização do procedimento de injeção, bem como da avaliação da viabilidade celular e do comportamento tumoral após a injeção.
Neste protocolo, fornecemos aos pesquisadores um guia passo a passo claro e detalhado para a injeção de linhas de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish e posterior fixação, imunostaining, imagem e quantificação do comportamento das células tumorais.
A crescente importância do zebrafish como modelo para o desenvolvimento do câncer e rastreamento de medicamentos resultou em inúmeras publicações3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. No entanto, a injeção de células cancerígenas em embriões de zebrafish é uma técnica que requer um alto nível de destreza que pode ser desafiador para os pesquisadores. Neste protocolo, nosso objetivo é fornecer informações práticas e algumas dicas que podem ajudar a superar os desafios iniciais da criação de xenoenxertos de embrião de zebrafish.
Injeção prévia de manuseio de células
Este protocolo otimizado para a geração de xenoenxertos de zebrafish com linhas celulares pode ser adaptado a vários tipos de células (câncer) com diferentes morfologias. Recomendamos que todas as linhas celulares usadas para xenoenxertos de zebrafish sejam livres de mycoplasma. Ao contrário de outras contaminações bacterianas, a presença de micoplasma na cultura celular não gera alterações que podem ser facilmente detectadas sob o microscópio22. A contaminação por mycoplasma pode afetar o potencial de engrafamento das linhas celulares, sua sensibilidade às drogas, bem como a viabilidade dos embriões de zebrafish.
Embora as células possam continuar a proliferar por um longo período, seu fenótipo e genótipo podem ser propensos a alterações. É importante se familiarizar com a morfologia e o comportamento das linhas celulares na cultura. Recomendamos manter o número de passagens celulares após o descongelamento entre 3-12 para obter resultados reprodutíveis. Assim, devem ser realizados testes regulares de mycoplasma.
As células devem estar em sua fase de registro (fase de crescimento exponencial antes de atingir a confluência ~70%) no dia da injeção. Isso permitirá um enxerto adequado e o desenvolvimento adequado das marcas distintas do tumor. Para evitar a variação do fenótipo das células dentro do xenoenxerto, é fundamental manter a confluência de injeção constante entre os experimentos. O número de células injetadas pode ser adaptado às características de cada linha celular, pois algumas podem exigir maiores densidades de injeção para prosperar nos embriões de zebrafish.
Considerações de rotulagem celular
Para melhor visualizar as células tumorais humanas para injeção e análise futura, as células tumorais podem ser rotuladas com corantes fluorescentes. Devido a diferenças no tamanho celular, o número total de células/cm2 em culturas aderentes varia entre as linhas celulares. Isso afetará a eficácia do protocolo de coloração, bem como o número de células colhidas para injeção. Grandes células que produzem números baixos por frasco (ou seja, Hs578T) ou crescem em clusters (ou seja, BFTC905) exigirão a junção de vários frascos para um único experimento. Neste caso, a coloração das células não deve ser realizada diretamente no frasco, pois isso causará o uso de quantidades excessivas de corante (alto custo). Por outro lado, as células altamente sensíveis aos ciclos excessivos de centrifugação, bem como aquelas que produzem números elevados por frasco (ou seja, HCT116) podem ser manchadas diretamente no frasco e, em seguida, destacadas com EDTA/raspador de células (Para obter mais informações ver Tabela 1).
Sempre que possível, em vez de usar uma abordagem enzimática, use EDTA para desprender as células no dia da injeção, para que as células recuperem suas junções célula-células mais rapidamente e sejam submetidas a menos passos de centrifugação. No entanto, se as células são sensíveis ao EDTA, muito aderentes ou crescem em clusters – um método enzimático pode ser aplicado. A otimização da concentração ideal para injeção, bem como o meio de injeção, depende das características de cada linha celular, podendo precisar de alguns ajustes(Tabela 1).
Calibração de microinjeção
Ao contrário da entrega de oligonucleotídeos ou drogas no embrião de zebrafish, uma ralticula não é usada para calibrar a agulha ao trabalhar com linhas celulares para xenertos. Depois de algum tempo durante a injeção, as células começarão a entupir, e é necessário cortar a ponta da agulha para aumentar seu diâmetro ou mudar completamente a agulha. Este procedimento dificulta a calibração do ralticule.
Para resolver esse problema, o número de células dispensadas é regulado pela pressão ejetar e o tempo necessário para atingir um tamanho semelhante ao olho embrião dentro de 1-3 pulsos. Em seguida, para controlar ainda mais o tamanho do tumor, a 1 dpi, os xenoenxertos são classificados de acordo com o tamanho do tumor, como mostrado na Figura 6 B-B”. Como representado no exemplo da Figura 6C, esse método de classificação é eficiente na redução da variação dos tamanhos dos tumores: se juntarmos todos (+,+++ o STEV é ~o dobro da classe ++(~906 células para ~422 células) e a variação do coeficiente é ~31,9% em comparação com 14,5% na classe ++. Como a referência para injeção é o volume, o número total de células varia muito entre os tipos de células – sendo dependentes do tamanho e forma das células. Por exemplo, células grandes com muito citoplasma como o câncer de mama Hs578T, produzem tumores muito menores (~600 células). Além disso, cada linha celular requer um número diferente de células. Por exemplo, as linhas de células cancerígenas urinárias HT29 CRC e RT112 mostraram que quanto maior o número de células injetadas, maior a mortalidade por zebrafish. Portanto, um período de otimização durante o desenvolvimento dos xenoenxertos é necessário para testar se a linha celular tem efeitos tóxicos no embrião ou requer densidades mais/menores de injeção.
Local de injeção
Uma das discrepâncias mais comuns na geração de xenoenxertos de embrião de zebrafish é o local da injeção. A gema é geralmente o local de escolha para a injeção devido à sua fácil acessibilidade. No entanto, observamos que as células injetadas na gema têm maior tendência a morrer. Embora tecnicamente mais difícil, recomendamos injetar no PVS e o mais longe possível do coração. Dentro do PVS, as células podem agregar, recrutar vasos e células imunes, e migrar, intravasar, extravasar e formar micrometastase, se apresentarem características metastáticas8,11.
Eficiência de engraftment
Diferenças na eficiência do enenerxerto e no tamanho do tumor entre as linhas celulares em 4 dpi são esperadas devido aos seus distintos graus de morte/sobrevivência/proliferação celular basal, mas também devido à imunogenicidade inata que cada linha celular pode exibir9.
metástase
A metástase compreende uma cascata de eventos que pode ser dividida em duas etapas arbitrárias. No primeiro estágio, as células tumorais têm que se desprender do local primário, migrar e invadir tecidos adjacentes e, em seguida, intravasar para a corrente sanguínea. No segundo estágio, as células tumorais devem sobreviver em circulação, extravasar-se do sangue ou vasos linfáticos, e finalmente colonizar em locais secundários23. Para distinguir entre esses eventos precoces e tardios e abordar o potencial/proficiência das diferentes células tumorais para realizar essas etapas, projetamos um ensaio simples.
Em geral, quando injetadas no PVS, as células tumorais podem entrar diretamente em circulação e, em seguida, ficar fisicamente presas no tecido hematopoiético caudal (CHT) (região da cauda). No entanto, de acordo com as características de cada célula tumoral – vimos que algumas células tumorais permanecem no CHT 4 dpi e são capazes de formar micrometastase enquanto outras células tumorais desaparecem (limpas após serem pegas no CHT).
Portanto, comparando a eficiência da micrometastase (a 4 dpi) quando as células foram colocadas diretamente em circulação – CIRC (as células só têm que passar pelos passos finais da metástase) vs. quando não – NO CIRC (as células precisam passar por etapas precoces e tardias para serem capazes de formar uma micrometastase) podemos avaliar seu potencial metastático precoce ou tardio. Observamos células tumorais que podem formar micrometastase eficientemente no CHT em ambos os grupos (CIRC e NO CIRC), sugerindo que essas células têm a capacidade de se submeter a todas as etapas da cascata metastática (SW480 e MDA-MB-468, por exemplo)8,11. Em contraste, outras células tumorais têm um potencial metastático muito baixo em ambos os grupos, quase nunca fazendo micrometastase, mesmo quando injetadas em circulação (ou seja, visíveis no CHT a 24 hpi, mas a 4 dpi elas não estão mais lá, Hs578T por exemplo)8. No entanto, encontramos claramente outro grupo – um que só é capaz de formar micrometastase quando injetado em circulação (só podemos observar micrometastase no grupo CIRC). Isso sugere que essas células têm baixa eficiência na realização dos primeiros passos da cascata metastática, mas, por outro lado, são capazes de sobreviver em circulação, extravasar e colonizar um local distante.
Imunostaining e imagem
Antes da fixação, este protocolo de injeção pode ser usado para outras abordagens de imagem ao vivo, como microscopia de contraste de interferência diferencial ao vivo (DIC), microscopia de disco giratório, imagem confocal ao vivo de alta resolução e microscopia de folha de luz, etc.
Células mortas e detritos celulares aparecem brilhantes quando observados através do estereóscópio fluorescente e podem ser confundidos com células vivas, especialmente se o objetivo do estudo é avaliar o potencial metastático das linhas celulares. Gostaríamos de salientar a importância da realização de imagens confocal com marcadores de viabilidade específicos e DAPI para avaliar o estado de sobrevivência do tumor e da micrometastase. Além disso, é fundamental usar anticorpos humanos específicos para detectar células humanas, como mitocôndrias anti-humanas ou HLA anti-humana. Ao implementar o protocolo, treine os olhos experimentador comparando a coloração no estereóscópio com as imagens confocal. Depois de algum tempo, os experimentadores podem distinguir claramente detritos de células vivas no estereóscópio fluorescente.
Embora outros métodos para quantificar a carga tumoral, como toda a área de fluorescência, sejam amplamente utilizados, recomendamos a realização de imunostaining de montagem inteira e imagem confocal como um método mais preciso. Não só a eficiência da coloração lipofílica de corante é muito variável (ou seja, algumas células são muito bem manchadas, enquanto outras não são – provavelmente devido ao conteúdo lipídico de suas membranas), mas também muitas vezes corantes lipofílicos formam agregados, e células mortas tendem a ser mais brilhantes – criando vários artefatos que podem ser confundidos com células vivas.
As células podem ser transduzidas com proteínas fluorescentes para ajudar no seu rastreamento e para pular a rotulagem celular. No entanto, certifique-se de que as células transduzidas e não transduzidas produzam os mesmos resultados nos xenoenxertos de zebrafish.
Além disso, os macrófagos podem fagociar esses detritos celulares fluorescentes tornando-se fluorescentemente rotulados e migrando, gerando falsas células metastáticas positivas. Assim, recomendamos uma série de ferramentas analíticas, que, naturalmente, podem ser estendidas a muitas outras leituras para uma interpretação mais precisa do comportamento tumoral:
Para uma aquisição confocal com intervalo de 5 μm entre as fatias na pilha Z das células cancerígenas de controle HCT116 (tamanho nuclear médio de 10-12 μm de diâmetro) com a contra-magem DAPI, observamos que ~50% das células são compartilhadas entre duas fatias consecutivas. Portanto, se cada fatia for contada, há um alto risco de contar as mesmas células duas vezes. Ir e voltar entre fatias para evitar problemas na quantificação resulta em uma técnica demorada e propensa a erros. Para facilitar a quantificação do número total de células e permitir mais reprodutibilidade entre os pesquisadores, criamos a fórmula de tamanho do tumor descrita anteriormente neste protocolo8.
Incluímos um número de correção (1,5) para explicar as células ~50% compartilhadas entre as fatias. Descobrimos que o erro médio de contagem manual de todo o tumor entre os pesquisadores foi de 20%. Dois pesquisadores que usaram a fórmula tiveram um erro de 2%. O uso desta fórmula tem uma taxa de precisão de 93% e 98% de taxa de reprodutibilidade. Também testamos métodos automatizados, mas eles demonstraram um erro superior a 50% causado por ajustes de limiar.
Devido às características das células apoptóticas, a quantificação das células Caspase 3 ativadas é mais difícil. Para reduzir o número de erros e a variação dos resultados, recomendamos que o controle e as amostras experimentais sejam contados pelo mesmo pesquisador. Além disso, ao aprender essa técnica, um novo pesquisador deve contar imagens que já foram quantificadas por pesquisadores mais experientes para comparar resultados e treinar.
O comprimento do ensaio pode ser estendido se necessário. No entanto, é importante considerar que as larvas de zebrafish requerem alimentação viva a partir de ~7 dias após a fertilização (5 dias após a injeção). Além disso, as diretrizes e regulamentos de bem-estar animal aplicados às larvas com mais de 6 dias após a fertilização podem variar.
Este protocolo fornece ferramentas úteis para permitir que um único pesquisador injete aproximadamente ~200-300 larvas de zebrafish por hora; e resultados para o ensaio completo, incluindo análise e interpretação estatística, obtidos em três semanas. Esperamos que este protocolo possa ajudar os pesquisadores a se tornarem especialistas na geração de xenoenxertos de zebrafish. Não é fácil; você precisa praticar, mas você vai chegar lá. Boa sorte!
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos à Fundação Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinanciado pela FCT/Lisboa2020) pelo financiamento. Bolsas FCT para VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Todos os membros do Laboratório Fior para discussões críticas; B. Costa e C. Rebelo de Almeida para compartilhamento de dados; e nossos membros do Laboratório C. Rebelo de Almeida, M. Barroso e L. Leite por sua participação no vídeo. Agradecemos a equipe de Comunicação, Eventos e Divulgação da CF (C. Certal, J. Monteiro et al) e Champalimaud, em especial Alexandre Azinheira, pela fantástica produção cinematográfica e Catarina Ramos e Teresa Fernandes pela ajuda.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |