ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

Summary

このプロトコルは、ショ ウジョウバエ ポリテン細胞のヘテロクロマチン集合体を可視化することを目的としている。

Abstract

免疫染色によるヘテロクロマチン凝集体の可視化は困難な場合があります。クロマチンの多くの哺乳類成分は、ショ ウジョウバエのメラノガスター で保存されている。したがって、ヘテロクロマチンの形成とメンテナンスを研究するための優れたモデルです。 第3インスター D.メラノガスター 幼虫の唾液腺に見られるような多テン化された細胞は、クロマチンが1000回近く増幅するのを観察するための優れたツールを提供し、研究者は核中のヘテロクロマチンの分布の変化を研究することを可能にしました。ヘテロクロマチン成分の観察はポリテーン染色体製剤で直接行うことができるが、一部のタンパク質の局在化は治療の重症度によって変化する可能性がある。したがって、細胞内のヘテロクロマチンの直接可視化は、この種の研究を補完する。本プロトコルでは、この組織に用いられる免疫染色技術、二次蛍光抗体の使用、および共焦点顕微鏡を用いて、これらのヘテロクロマチン凝集体をより精密かつ詳細に観察する方法について述べる。

Introduction

エミール・ハイツ¹の初期研究以来、ヘテロクロマチンは、遺伝子発現、染色体のmeioticおよびmitotic分離、およびゲノム安定性^2、3、4の維持などの細胞プロセスの重要な調節因子と考えられてきました。

ヘテロクロマチンは、主に、反復配列を特徴的に定義する構成ヘテロクロマチンと、テロメアやセントロメレスなどの特定の染色体部位に存在する変容可能な要素の2つに分けられます。この種のヘテロクロマチンは、ヒストンH3のリシン9のジまたはトリメチル化(H3K9me3)およびヘテロクロマチンタンパク質1a(HP1a)5,6の結合などの特異的ヒストンマークによって主にエピジェネティックに定義される。一方、栄養性ヘテロクロマチンは染色体の腕を通して局所化し、主に発達的に沈黙した遺伝子^7、8から構成される。メタフェーズ細胞におけるヘテロクロマチンブロックの免疫染色、または相間細胞におけるヘテロクロマチン凝集体の観察は、ヘテロクロマティック領域⁹の形成および機能の理解において多くの光を明らかにした。

モデルシステムとしてのショウジョウバエの使用により、電子顕微鏡¹⁰を使用せずにヘテロクロマチンを研究するための必須ツールの開発が可能になった。HP1aなどのヘテロクロマチン関連タンパク質の位置効果変化や発見、ヒストン翻訳後修飾の記述以来、多くのグループはこれらの異球領域^10,11の可視化を可能にするいくつかの免疫組織化学的手法を開発してきた。

これらの技術は、ヘテロクロマチン関連タンパク質またはヒストンマークを認識する特定の抗体の使用に基づいています。細胞の種類や抗体ごとに、固定および透過性の条件を経験的に決定する必要があります。また、スカッシュ技術などの追加の機械的プロセスを使用する場合にも条件が異なる場合があります。このプロトコルでは、ショ ウジョウバエ 唾液腺を用いて異血球性病巣を研究することを説明する。唾液腺は、ゲノムの1,000部以上を含む多着細胞を有しており、衛星DNAおよび複製中の一部の異血球領域を除いて、クロマチンの特徴の大部分を増幅したビューを提供する。それにもかかわらず、ヘテロクロマチン領域はポリテーン染色体製剤で容易に可視化されるが、スカッシュ技術は、特徴的なクロマチン結合複合体またはクロマチンアーキテクチャを破壊する場合がある。したがって、唾液腺組織全体におけるタンパク質の免疫局在化は、これらの望ましくない効果を上回る可能性がある。我々は、いくつかのクロマチン結合タンパク質を検出するためにこのプロトコルを使用しており、我々は、変異型 ショウジョウバエ 株と組み合わせたこのプロトコルは、ヘテロクロマチン破壊¹²を研究するために使用することができることを実証した。

Protocol

1. 第三のインスター幼虫文化 1リットルの酵母、100gの未精製の全てのサトウキビ砂糖、16gの寒天、プロピオン酸10mL、ゼラチン14gを加えて、標準培地を1リットル用意します。800mLの水道水に酵母以外の成分をすべて溶解し、酵母を溶解します。30分間すぐにオートクレーブ。 その後、培地を60°Cまで冷却し、プロピオン酸を最終濃度0.01%に加えます。ゼラチンが形成されるまでボ?…

Representative Results

ショウジョウバエ唾液腺におけるHP1a免疫染色の代表的な結果を図1に示す。肯定的な結果は、1つの焦点(図1a)(不均一な凝集または凝縮物)を観察する。負の結果は信号または分散信号ではありません。二重信号、つまり二重点(図1c)を観測できる場合がありますが、通常は少量で発生します。 データ?…

Discussion

真核生物の細胞機能は、核内の3D構造を定義することができ、これはクロマチンとの異なるタンパク質とRNAを含む様々な分子との相互作用によって支えられる。過去3年間で、ヘテロクロマチンを含む関連性を有する生物学的凝縮物は、活性クロマチン^16、17、18の明確な核空間組織を促進する相分離の決定において基本的な役割^を<sup class="xre…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical