Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae
Summary
Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie sequencing (ChIP-seq) is een krachtige en veel gebruikte moleculaire techniek voor het in kaart brengen van hele genoomlocaties van transcriptiefactoren (TF’s), chromatineregulatoren en histonmodificaties, evenals het detecteren van volledige genomen voor het blootleggen van TF-bindingspatronen en histon posttranslatiele modificaties. Chromatinemodificerende activiteiten, zoals histonmethylatie, worden vaak gerekruteerd voor specifieke genregulerende sequenties, waardoor gelokaliseerde veranderingen in chromatinestructuren ontstaan en resulteren in specifieke transcriptionele effecten. De rijstexplosie is een verwoestende schimmelziekte op rijst over de hele wereld en is een modelsysteem voor het bestuderen van schimmel-plantinteractie. De moleculaire mechanismen in hoe de histonmodificaties hun virulentiegenen in Magnaporthe oryzae reguleren, blijven echter ongrijpbaar. Meer onderzoekers moeten ChIP-seq gebruiken om te bestuderen hoe histon epigenetische modificatie hun doelgenen reguleert. ChIP-seq wordt ook veel gebruikt om de interactie tussen eiwit en DNA in dieren en planten te bestuderen, maar het wordt minder gebruikt op het gebied van plantenpathologie en is niet goed ontwikkeld. In dit artikel beschrijven we het experimentele proces en de werkwijze van ChIP-seq om de genoombrede verdeling van histonmethylatie (zoals H3K4me3) te identificeren die bindt aan de functionele doelgenen in M. oryzae. Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.
Introduction
Epigenetica is een tak van genetisch onderzoek die verwijst naar de erfelijke verandering van genexpressie zonder de nucleotidesequentie van genen te veranderen. Een toenemend aantal studies heeft aangetoond dat epigenetische regulatie een belangrijke rol speelt bij de groei en ontwikkeling van eukaryote cellen, waaronder chromatine dat genexpressie reguleert en beïnvloedt door het dynamische proces van vouwen en assembleren in structuren van hogere orde1,2. Chromatineremodellering en covalente histonmodificatie beïnvloeden en reguleren de functie en structuur van chromatine door de variatie van chromatinepolymeren, waardoor de functie van het reguleren van genexpressie3,4,5,6wordt bereikt. Posttranslatiele modificaties van histon omvatten acetylering, fosforylering, methylatie, monoubiquitinatie, sumylering en ADP ribosylatie7,8,9. Histon H3K4-methylatie, met name trimethylatie, is in kaart gebracht op transcriptiestartplaatsen waar het wordt geassocieerd met transcriptiereplicatie, recombinatie, reparatie en RNA-verwerking in eukaryoten10,11.
ChIP-seq-technologie werd geïntroduceerd in 2007 en is de experimentele standaard geworden voor de genoombrede analyse van transcriptionele regulatie en epigenetische mechanismen12,13. Deze methode is geschikt op genoombrede schaal en voor het verkrijgen van histon- of transcriptiefactorinteractie-informatie, inclusief DNA-segmenten van DNA-bindende eiwitten. Alle DNA-sequenties die zijn gekoppeld aan interessante eiwitten, zullen samen neerslaan als onderdeel van het chromatinecomplex. Sequencingtechnieken van de nieuwe generatie worden ook gebruikt om 36-100 bp DNA te sequencen, die vervolgens worden gematcht met het overeenkomstige doelgenoom.
In fytopathogene schimmels is onlangs onderzoek begonnen om te bestuderen hoe histonmethylatiemodificaties hun doelgenen reguleren in het proces van pathogeniciteit. Sommige eerdere studies bewezen dat de regulatie van histonmethylase-gerelateerde genen voornamelijk wordt weerspiegeld in gen-uitschakeling en katalysering van de productie van secundaire metabolieten (SM). MoSet1 is de H3K4 methylase in M. oryzae. Knock-out van dit gen resulteert in de volledige deletie van H3K4me3 modificatie14. Vergeleken met de wild-type stam, de expressie van het gen MoCEL7C in de mutant wordt geremd in de CMC-geïnduceerde toestand en in de niet-geïnduceerde toestand (glucose of cellobiose), de expressie van MoCEL7C verhoogd15. In Fusarium graminearumkan KMT6 de methylatiemodificatie van H3K27me3 katalyseren, de normale ontwikkeling van schimmels reguleren en helpen bij het reguleren van het “cryptische genoom” dat het SM-gencluster16,17,18,19bevat. In 2013 meldde Connolly dat H3K9- en H3K27-methylatie het pathogene proces van schimmels reguleert via secundaire metabolieten en effectorfactoren die de remming van doelgenen reguleren20. In Aspergillusis de modificatie van histonen H3K4me2 en H3K4me3 gerelateerd aan genactivering en speelt een belangrijke rol bij het beheersen van de chromatineniveauregulatie van SM-genclusters21. In M. oryzaeis Tig1 (homoloog aan Tig1 bij gist en zoogdieren) een HADC (histon deacetylase)22. Knock-out van het Tig1-gen leidt tot het volledige verlies van pathogeniciteit en sporenproductievermogen in de nulmutant. Het is gevoeliger voor een peroxygeenomgeving, die geen infectieuze schimmeldraden kan produceren22.
De rijstexplosie veroorzaakt door M. oryzae. is een van de ernstigste rijstziekten in de meeste rijstteeltgebieden ter wereld19. Vanwege het representatieve infectieproces is M. oryzae vergelijkbaar met het infectieproces van veel belangrijke pathogene schimmels. Omdat het gemakkelijk moleculair genetische operaties kan uitvoeren, is de schimmel een modelorganisme geworden voor het bestuderen van schimmel-plantinteracties23. Het blokkeren van elke stap van het infectieproces van M. oryzae kan leiden tot een mislukte infectie. De morfologische veranderingen tijdens het infectieproces worden strikt gereguleerd door de gehele genoomfunctie en gentranscriptie. Onder hen spelen epigenetische modificaties zoals histonmethylatie een essentiële rol in de transcriptionele regulatie van functionele genen24,25. Tot nu toe zijn er echter weinig studies gedaan naar het moleculaire mechanisme van epigenetische modificaties zoals histonmethylatie en histonacetylering in de transcriptie van pathogenesegenen in M. oryzae. Daarom zal de verdere ontwikkeling van het epigenetische regulatiemechanisme van de rijststraalschimmel, terwijl onderzoek wordt gedaan naar het upstream- en downstream-regulerende netwerk van deze pathogene gerelateerde genen, helpen bij het ontwikkelen van strategieën voor het voorkomen en beheersen van rijststralen.
Met de ontwikkeling van functionele genomica zoals ChIP-seq, vooral in de epigenetica, heeft deze high-throughput data-acquisitiemethode het onderzoek naar chromosomen versneld. Met behulp van de ChIP-seq experimentele technologie kan de genoombrede verdeling van histonmethylatie (zoals H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae en andere filamenteuze schimmels worden geïdentificeerd. Daarom kan deze methode helpen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hoe epigenetische modificaties hun kandidaat-doelgenen reguleren tijdens schimmelpathogenese in plantenpathologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onlangs is ChIP-seq een veelgebruikte genomische analysemethode geworden voor het bepalen van de bindingsplaatsen van TFs of verrijkingsplaatsen die zijn gewijzigd door specifieke histonen. Vergeleken met eerdere ChIP-seq-technologie is de nieuwe ChIP-seq-technologie zeer gevoelig en flexibel. Resultaten worden geleverd in hoge resolutie zonder negatieve effecten, zoals het ruissignaal veroorzaakt door de niet-specifieke hybridisatie van nucleïnezuren. Hoewel dit een veel voorkomende genexpressieanalyse is, zijn veel co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), het Special Scientific Research Project van Beijing Agriculture University (YQ201603), het Scientific Project van Beijing Educational Committee (KM201610020005), het High-level scientific research cultivation project van BUA (GJB2021005).
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
