Summary

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

Published: June 02, 2021
doi:

Summary

ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。

Abstract

クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子(TF)、クロマチン調節因子、ヒストン修飾の全ゲノム位置をマッピングし、TF結合パターンおよびヒストンポスト修飾を明らかにするための全ゲノムを検出するための強力で広く使用されている分子技術です。ヒストンメチル化などのクロマチン修飾作用は、特定の遺伝子調節配列に採用されることが多く、クロマチン構造の局所的な変化を引き起こし、特定の転写効果を生じる。米の爆発は、世界中の米に壊滅的な真菌病であり、真菌と植物の相互作用を研究するためのモデルシステムです。しかし、ヒストン修飾が Magnaporthe oryzae の毒性遺伝子をどのように調節するかの分子メカニズムは依然として不可解である。より多くの研究者は、ヒストンエピジェネティック修飾が標的遺伝子をどのように調節するかを研究するためにChIP-seqを使用する必要があります。また、動物や植物のタンパク質とDNAの相互作用を研究するために広く使用されていますが、植物病理学の分野ではあまり使用されておらず、十分に開発されていません。本論文では 、M.オリザ エの機能性標的遺伝子に結合するヒストンメチル化(H3K4me3など)のゲノム全体分布を同定するための、ChIP-seqの実験過程と操作方法について述べた。ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。

Introduction

エピジェネティクスは、遺伝子の塩基配列を変化させることなく遺伝子発現の遺伝性変化を指す遺伝子研究の一分野です。エピジェネティックな調節が真核細胞の増殖と発達において重要な役割を果たしていることを示す研究が増えているが、折りたたみと組み立ての動的過程を通じて遺伝子発現を制御し、影響を与えるクロマチンを含む1,2.クロマチンリモデリングおよび共有ヒストン修飾は、クロマチンポリマーの変動を通じてクロマチンの機能および構造に影響を及ぼし、それにより遺伝子発現3、4、5、6を調節する機能を達成する。ヒストンの翻訳後修飾には、アセチル化、リン酸化、メチル化、モノユビキチン化、相総化、およびADPリボシル化7、8、9が含まれる。ヒストンH3K4メチル化、特にトリメチル化は、真核生物10,11における転写複製、再結合、修復、およびRNA処理に関連する転写開始部位にマッピングされている。

ChIP-seq技術は2007年に導入され、転写制御およびエピジェネティック機構12,13のゲノム全体解析の実験基準となっている。この方法は、ゲノムワイドスケールで、DNA結合タンパク質のDNAセグメントを含むヒストンまたは転写因子相互作用情報を得るのに適している。目的のタンパク質に架橋されたDNA配列は、クロマチン複合体の一部として共沈殿します。新世代シーケンシング技術は、36-100bpのDNAを配列するためにも使用され、その後、対応する標的ゲノムと一致する。

植物病原性真菌では、最近、ヒストンメチル化修飾が病原性の過程で標的遺伝子をどのように調節するかを研究し始めている。いくつかの以前の研究は、ヒストンメチラーゼ関連遺伝子の調節が主に遺伝子サイレンシングおよび二次代謝産物(SM)の産生を触媒することに反映されることを証明した。MoSet1は、MオリザエのH3K4メチラーゼです。この遺伝子のノックアウトは、H3K4me3改変14の完全な欠失をもたらす。野生型株と比較して、変異体における遺伝子MoCEL7Cの発現は、CMC誘発状態および非誘導状態(グルコースまたはセロビオース)において阻害され、MoCEL7Cの発現は15増加した。Fusarium graminearumでは、KMT6はH3K27me3のメチル化修飾を触媒し、真菌の正常な発達を調節し、SM遺伝子クラスター16、17、18、19を含む「暗号ゲノム」を調節するのに役立つ。2013年、コノリーは、H3K9およびH3K27メチル化が、標的遺伝子20の阻害を調節する二次代謝産物およびエフェクター因子を通じて真菌の病原性プロセスを調節すると報告した。アスペルギルスにおいて、ヒストンH3K4me2およびH3K4me3の改変は、遺伝子活性化に関連しており、SM遺伝子クラスター21のクロマチンレベル調節を制御する上で重要な役割を果たす。M.オリザエにおいて、Tig1(酵母および哺乳動物におけるTig1に相同性)はHADC(ヒストンデアセチラーゼ)22である。Tig1遺伝子のノックアウトは、ヌル突然変異体における病原性および胞胞体産生能力の完全な喪失をもたらす。感染性ヒphphae22を産生できない過酸素環境に対してより敏感である。

M.oryzae.によって引き起こされる米の爆発は、世界で最も深刻な米の病気の一つです19.その代表的な感染過程のために、M.oryzaeは多くの重要な病原性真菌の感染過程に類似している。容易に分子遺伝学的操作を行うことができるので、真菌は真菌と植物の相互作用を研究するためのモデル生物23となっている。M.オリザエの感染過程のすべてのステップを遮断すると、感染が失敗する可能性があります。感染過程における形態変化は、ゲノム機能全体と遺伝子転写によって厳密に調節される。中でも、ヒストンメチル化などのエピジェネティック修飾は、機能性遺伝子24,25の転写調節に不可欠な役割を果たす。しかし、これまでのところ、M.オリザエにおける病原性遺伝子の転写におけるヒストンメチル化およびヒストンアセチル化などのエピジェネティック修飾の分子機構に関する研究はほとんど行われていない。したがって、これらの病原性遺伝子の上流および下流の調節ネットワークを研究しながら、稲芽菌のエピジェネティックな調節機構をさらに開発することは、米爆風予防および制御戦略の開発に役立つ。

特にエピジェネティクスにおけるChIP-seqなどの機能性ゲノミクスの開発により、このハイスループットデータ取得法により染色体の研究が加速されました。ChIP-seq実験技術を用いて 、M.オリザエ および他の糸状菌におけるヒストンメチル化(H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3など)のゲノム全体の分布を同定することができる。したがって、この方法は、エピジェネティック修飾が植物病理における真菌病因の間に候補標的遺伝子を調節する方法の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。

Protocol

1. Mオリザエからのプロトプラストの調製 オートミールトマト寒天(OTA)を準備します。 オートミールの30〜50gの重量を量り、20分間水(ddH2O)の800 mLでそれを沸騰させます。ガーゼの2層を通してフィルタリングし、濾液を取ります。 熟したトマトを選び、皮をむきます。ジュースを絞り、2層のガーゼを通して濾過し、濾過されたジュースの150 mLを集めます。</…

Representative Results

図1に、ChIP-seq メソッドの全体のフローチャートを示します。ChIP-seq実験は、野生型株P131におけるH3K4me3に対する抗体と、m.オリザエにおけるヒストンH3K4me3分布の全ゲノムワイドプロファイルを検証するために、mobre2、mospp1、およびmoswd2遺伝子を欠いていた3つのヌル変異株に対する抗体を用いて行った。野生型株のプロトプラスト、Δモブレ<…

Discussion

近年、ChIP-seqは、特定のヒストンによって改変されたTFまたは濃縮部位の結合部位を決定するためのゲノム解析法として広く用いられている。従来のChIP-seqテクノロジーと比較すると、新しいChIP-seq技術は高感度で柔軟性に優れています。核酸の非特異的なハイブリダイゼーションによって生じるノイズ信号など、負の影響を受けることなく高解像度で得られます。これは一般的な遺伝子発現?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国立自然科学財団(31871638グラント)、北京農業大学特別科学研究プロジェクト(YQ201603)、北京教育委員会の科学プロジェクト(KM201610020005)、BUA(GJB2021005)の高レベル科学研究育成プロジェクトによって支援されました。

Materials

acidic casein hydrolysate WAKO 65072-00-6 Medium configuration
agar powder scientan 9002-18-0 Medium configuration
deoxycholic acid MedChemExpress 83-44-3 protein and dissolution
DNA End-Repair kit NovoBiotec ER81050 Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads Invitrogen no.100.02D Binding target
EB buffer JIMEI JC2174 Membrane and liquid
EDTA ThermoFisher AM9912 protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate Sigma 91079-40-2 Medium configuration
glucose Sigma 50-99-7 Medium configuration
glycogen ThermoFisher AM9510 Precipitant action
H3K4me3 antibodies Abcam ab8580 Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer illumina illumina Hiseq 2000 Large configuration
Illumina PCR primers illumina CleanPlex Random universal primer
isoamyl alcohol chemical book 30899-19-5 Purified DNA
LiCl ThermoFisher AM9480 specific removal RNA
lysing enzymes Sigma L1412-10G cell lysis buffer
Mouse IgG Yeasen 36111ES10 Animal normal immunoglobulin
NaCl solution ThermoFisher 7647-14-5 Medium configuration
NaHCO3 Seebio SH30173.08* preparation of protein complex eluent
NP-40 ThermoFisher 85124 cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit Qiagen 28004 The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors ThermoFisher A32965 A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K ThermoFisher AM2546 DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0 ThermoFisher Q33226 Medium configuration
RIPA buffer ThermoFisher 9806S cell lysis buffer
RNase A ThermoFisher AM2271 Purified DNA
SDS ThermoFisher AM9820 cover up the charge differences
sodium acetate solution ThermoFisher R1181 Acetic acid buffer
sodium deoxycholate ThermoFisher 89904 inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase ThermoFisher EL0011 Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer ThermoFisher B69 DNA ligase buffer
Tris-HCl ThermoFisher 1185-53-1 buffer action
Triton X-100 ThermoFisher HFH10 keep the membrane protein stable
yeast extract OXOID LP0021 Medium configuration

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  4. Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
  5. Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
  6. Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
  7. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
  8. Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
  9. Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
  10. Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
  11. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  12. Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
  13. Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
  14. Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
  15. Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
  16. Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
  17. Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
  18. Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
  19. Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
  20. Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
  21. Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
  22. Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
  23. Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
  24. Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
  25. Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
  26. Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
check_url/62423?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Wu, Z., Sun, W., Zhou, S., Zhang, L., Zhao, X., Xu, Y., Wang, W. Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae. J. Vis. Exp. (172), e62423, doi:10.3791/62423 (2021).

View Video