Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

Summary

Nous montrons comment utiliser un nouvel instrument d’analyse de suivi des nanoparticules pour estimer la distribution de taille et la concentration totale de particules de vésicules extracellulaires isolées du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain.

Abstract

Les rôles physiologiques et physiopathologiques des vésicules extracellulaires (VE) sont de plus en plus reconnus, faisant du domaine des VÉHICULES électriques un domaine de recherche en évolution rapide. Il existe de nombreuses méthodes différentes pour l’isolation des véhicules électriques, chacune présentant des avantages et des inconvénients distincts qui affectent le rendement en aval et la pureté des véhicules électriques. Ainsi, caractériser la préparation EV isolée d’une source donnée par une méthode choisie est importante pour l’interprétation des résultats en aval et la comparaison des résultats entre les laboratoires. Diverses méthodes existent pour déterminer la taille et la quantité de VE, qui peuvent être modifiées par des états pathologiques ou en réponse à des conditions externes. L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est l’une des principales technologies utilisées pour l’analyse à haut débit des véhicules électriques individuels. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la quantification et la détermination de la taille des VE isolés du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain à l’aide d’une technologie révolutionnaire pour la NTA représentant des avancées majeures dans le domaine. Les résultats démontrent que cette méthode peut fournir des données reproductibles et valides sur la concentration totale des particules et la distribution granulométrique pour les VE isolés de différentes sources à l’aide de différentes méthodes, comme le confirme la microscopie électronique à transmission. L’adaptation de cet instrument à la NTA permettra de répondre à la nécessité d’une normalisation des méthodes de la NTA afin d’accroître la rigueur et la reproductibilité dans la recherche sur les VE.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules membranaires (0,03-2 μm) sécrétées par presque tous les types de cellules^1. Ils sont souvent appelés « exosomes », « microvésicules » ou « corps apoptotiques » en fonction de leur mécanisme de libération et de leur taille^2. Alors qu’on pensait au départ que les VE étaient simplement un moyen d’éliminer les déchets de la cellule pour maintenir l’homéostasie^3,nous savons maintenant qu’ils peuvent également participer à la communication intercellulaire via le transfert de matériel moléculaire – y compris l’ADN, l’ARN (ARNm, microARN), les lipides et les protéines^4,5 – et qu’ils sont d’importants régulateurs de la physiologie normale ainsi que des processus pathologiques^{1, 5,6,7,8}.

Il existe de nombreuses méthodes différentes pour isoler et quantifier les VE, qui ont été décrites^{ailleurs 9,10,11,12}. Le protocole d’isolement utilisé ainsi que la source des véhicules électriques peuvent avoir un impact considérable sur le rendement et la pureté des véhicules électriques. Même la centrifugation différentielle, longtemps considérée comme l’approche « étalon-or » pour l’isolement des exosomes, peut être sujette à une variabilité substantielle ayant par la suite un impact sur la population de VE obtenue et les analyses en aval^13. Ainsi, les différentes méthodologies d’isolement et de quantification des VE rendent difficile la comparaison, la reproduction et l’interprétation des résultats des expériences rapportées dans la littérature^14. En outre, la libération de VE peut être régulée par des conditions cellulaires ou divers facteurs externes. Il a été suggéré que les VE jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie cellulaire en protégeant les cellules contre le stress intracellulaire¹⁵, car plusieurs études ont montré que le stress cellulaire stimule la sécrétion de VE. Parexemple, une augmentation de la libération de VE a été rapportée après une exposition cellulaire à l’hypoxie, au stress du réticulum endoplasmique, au stress oxydatif, au stress mécanique, à l’extrait de fumée de cigarette et à la pollution de l’air par les particules^16,17,18^,19, 20^,21,22. Il a également été démontré que la libération de VE est modifiée in vivo; les souris soumises à un régime riche en graisses ou à un jeûne pendant seize heures ont libéré plus de VE adipocytaires²³. Pour déterminer si un traitement ou une affection spécifique modifie la libération de VE, le nombre de VE doit être déterminé avec précision. L’évaluation de la distribution de la taille des VE peut également indiquer l’origine subcellulaire prédominante des VE (p. ex., fusion d’endosomes/corps multivésiculaires tardifs avec la membrane plasmique par rapport au bourgeonnement de la membrane plasmique)²⁴. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes robustes pour mesurer avec précision la concentration totale et la distribution granulométrique de la préparation ev étudiée.

Une méthode rapide et très sensible pour la visualisation et la caractérisation des véhicules électriques en solution est l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Une explication détaillée des principes de cette méthode et une comparaison avec d’autres méthodes d’évaluation de la taille et de la concentration des VE ont été décrites précédemment^25,26,27,28. En bref, lors de la mesure NTA, les véhicules électriques sont visualisés par la lumière diffusée lorsqu’ils sont irradiés avec un faisceau laser. La lumière diffusée est focalée par un microscope sur une caméra qui enregistre le mouvement des particules. Le logiciel NTA suit le mouvement thermique aléatoire de chaque particule, connu sous le nom de mouvement brownien, pour déterminer le coefficient de diffusion qui est utilisé pour calculer la taille de chaque particule à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein. La NTA a été appliquée pour la première fois à la mesure des VE dans un échantillon biologique en 2011²⁵. Jusqu’à récemment, il n’y avait que deux sociétés grand public offrant des instruments NTA commerciaux²⁹ jusqu’à l’introduction du ViewSizer 3000 (ci-après dénommé l’instrument de suivi des particules) qui utilise une combinaison de nouvelles solutions matérielles et logicielles pour surmonter les limites importantes d’autres techniques NTA.

L’instrument de suivi des particules caractérise les nanoparticules dans les échantillons liquides en analysant leur mouvement brownien et caractérise les particules plus grosses de la taille d’un micron en analysant la décantation gravitationnelle. Le système optique unique de cet instrument, qui comprend un éclairage multispectral avec trois sources de lumière laser (à 450 nm, 520 nm et 635 nm), permet aux chercheurs d’analyser simultanément un large éventail de tailles de particules (par exemple, exosomes, microvésicules). Un schéma de la configuration de l’instrument est illustré à la figure 1.

Ici, nous montrons comment effectuer des mesures de distribution granulométrique et de concentration de véhicules électriques isolés de souris et d’humains à l’aide d’un nouvel instrument NTA.

Figure 1: Système optique d’instrument de suivi des particules. L’instrument NTA éclaire les particules à l’aide de trois lasers avec les longueurs d’onde suivantes : 450 nm, 520 nm, 635 nm. L’enregistrement vidéo de la lumière diffusée à partir de particules individuelles est détecté et suivi par une caméra vidéo numérique orientée à 90 ° de la cuvette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Tous les travaux avec ces échantillons ont été effectués conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement et du Comité d’examen de l’établissement. Une vue d’ensemble schématique de la méthode NTA est illustrée à la figure 2. Figure 2: Vue…

Representative Results

Avant cette démonstration, l’étalonnage de l’instrument a d’abord été testé pour s’assurer de la validité des données acquises en mesurant la distribution granulométrique des étalons de billes de polystyrène. Nous avons testé la distribution de taille des billes de 100 nm et 400 nm en utilisant les paramètres d’enregistrement par défaut et les paramètres de traitement recommandés dans ce protocole (Figure 8). Pour l’étalon de billes de …

Discussion

Ici, nous démontrons un protocole pour la NTA des VE pour mesurer simultanément la distribution granulométrique d’une large gamme de tailles de particules et mesurer la concentration totale de VE dans un échantillon polydispersé. Dans cette étude, le tissu adipeux périgornadique de souris et le plasma humain ont été utilisés comme source de VE. Cependant, les VE isolés d’autres tissus ou liquides biologiques tels que le sérum, l’urine, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique et le surnageant …

Materials

1X dPBS	VWR	02-0119-1000	To dilute samples
100 nm bead standard	Thermo Scientific	3100A	To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard	Thermo Scientific	3400A	To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC901024	To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL	Qiagen	19201	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster	DustOff	DPSJB-12	To clean cuvettes
Cuvette insert	HORIBA Scientific	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig	HORIBA Scientific	–	To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water	VWR	02-0201-1000	To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables	Dell	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore Sigma	–	To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids	Thermo Scientific	B780020	To clean cuvettes
"Hook" tool	Excelta	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth	Texwipe	TX629	To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	22363344	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	–	Nanoparticle tracking instrument