赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御
Summary
ここで示すプロトコルは、哺乳類細胞内の細胞骨格構造を研究するために細胞形状を標準化するマイクロパターンの自動製作を可能にする。このユーザーフレンドリーな技術は市販のイメージ投射システムと設定することができ、標準的な細胞生物学の実験室にアクセスできない専門の装置を要求しない。
Abstract
マイクロパターニングは、自然な細胞間変動から生じる合併症を回避しながら、細胞コンパートメントの形態と機能の間の関係を研究するために使用される細胞生物学コミュニティで確立された技術です。細胞形状を標準化するために、セルは3D金型に閉じ込められるか、接着的な島を通して接着幾何学のために制御されます。しかし、フォトリソグラフィとディープUVエッチングに基づく従来のマイクロパターニング技術は、クリーンルームや特殊な設備に大きく依存しています。ここでは、市販の撮像システムで簡便に設定できる、ドイルらから改変された赤外線レーザー支援マイクロパターン化技術(マイクロフォトパターン化)を提示する。このプロトコルでは、ニコンA1R MP+イメージングシステムを使用して、ポリビニルアルコールコーティングカバーリップ上のプリセット領域をアブラプターする赤外線(IR)レーザーを介してミクロン精度のマイクロパターンを生成します。ハードウェアオートフォーカスを搭載していないシステムでは、高効率かつ精度の高いパターン製作を可能にするカスタムスクリプトを採用しています。我々は、このIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞が排他的に取り付け、所望の形状を取る定義されたパターンをもたらすことを示す。さらに、セル形状の標準化により、多数の細胞からのデータを平均化することができる。このプロトコルで生成されたパターンは、高解像度のイメージングと定量分析と組み合わせて、比較的高いスループット画面に使用して、形態と機能の間のリンクを媒介する分子プレーヤーを識別することができます。
Introduction
細胞形状は、組織形態形成1、細胞遊び出し2、細胞増殖3、遺伝子発現4などの基本的な生物学的プロセスの重要な決定因子である。細胞形状の変化は、細胞膜を変形させる細胞骨格の動的再配置と、細胞に及ぶ外力などの外的要因と、細胞細胞および細胞マトリックス接着の幾何学的形状との間の複雑なバランスによって駆動される。例えば、間葉系細胞の移動は、血漿膜を前方に押し出し、広いラメリポディア6を作成する先端に密なアクチンネットワークを重合し、アクトミオシン収縮は細胞の狭い後縁を引き込んで現在位置7,8から細胞を取り外す。このような特殊な細胞骨格構造を摂動するようなシグナル伝達事象を破壊し、細胞の移動を遅くする9.また、胃の中での上皮シートの曲げには、細胞とその隣人がくさび状の10になる原因となるアクトミオシンベースの尖語狭窄が必要です。これらの研究は細胞形状の重要性を強調しているが、細胞形状の固有の不均一性は、形態を機能に結びつけるメカニズムを特定する努力を妨げている。
このため、細胞の形状を操作するための数多くのアプローチが過去30年間に開発されました。これらのアプローチは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を防汚表面にパターン化して細胞接着幾何学的形状を3次元型で拘束するか、または細胞接着幾何学を制御することによって、その目標を達成する、マイクロパターニング11と呼ぶ技術である。ここでは、長年にわたって人気を集めている技術の数を確認します。
もともとマイクロエレクトロニクスアプリケーションのアプローチとして開拓されたソフトリソグラフィベースのマイクロコンタクト印刷は、明らかにカルトのお気に入り12になっています。マスターウエハは、まずフォトレジスト被覆シリコン基板の領域を光照射に選択的に露出させることによって作製され、パターン化された表面13を残す。次いで、PDMSなどのエラストマーをマスターウエハに注ぎ、ECMタンパク質を所望の基質11,14に移すソフトな「スタンプ」を生成する。製造されると、マスターウエハを使用して、再現性の高いマイクロパターン12を生じさせる多くのPDMSスタンプをキャストすることができる。しかし、長いフォトリソグラフィプロセスのためにパターンを容易に調整することはできません。このプロセスには、生物学部門では一般的に利用できない高度に特殊な機器とクリーンルームも必要です。
最近では、深いUVを用いたダイレクト印刷は、従来のリソグラフィーベースのアプローチによってもたらされる限界を回避することが報告されている。深いUV光は、ポリL-リジン-移植-ポリエチレングリコールでコーティングガラスカバースリップの選択的領域にフォトマスクを介して向けられる。深部UVにさらされた化学基は、感光リンカーを使用せずに光変換され、ECMタンパク質15の結合を可能にする。感光リンカーの欠如は、パターン化されたカバーリップが7ヶ月以上室温で安定したままであることを可能にします15.この方法はクリーンルームおよびフォトリソグラフィ装置の使用を避け、より少ない専門訓練を必要とする。しかし、フォトマスクの要件は、パターンの容易に利用可能な変更を必要とする実験のための実質的なハードルをまだ提起します。
また、2D表面にECMタンパク質を制御して細胞の形状を操作する方法に加えて、細胞を3D微細構造に閉じ込めることで細胞形状を制御する方法も模索しています。多くの研究は、胚、細菌、酵母および植物16、17、18、19における形状依存性生物学的プロセスを調査するために、2Dではなく、PDMSチャンバーを生成するために、上記のソフトリソグラフィーベースのアプローチを適応させた。二光子重合(2PP)はまた、ナノメートル分解能20で複雑な3Dヒドロゲル足場を作り出すことができる微細加工技術としてリードを取った。2PPは、2光子吸着の原理に依存しており、フェムト秒パルスで送達される2つの光子は、光重合体21の局所重合を可能にする分子(この場合は光発合剤)によって同時に吸収される。この技術は、ヒト組織のネイティブECM構造を模倣する3D足場を印刷するために多用されており、細胞22に低い光化学的損傷を誘導することが示されている。
10年前のマイクロフォトパターニングのデビューにより、研究者はアクセス不能で特殊な機器を避けながらマイクロパターンを製造する機会を得ました。マイクロフォトパターン化は、赤外線レーザー23,24を用いて活性ガラス表面に被覆されたポリビニルアルコール(PVA)の選択的領域を熱的に除去することにより、ミクロンスケールのパターンを作成する。PVAではなく下層ガラス表面のみを取り付けるECMタンパク質は、制御された拡散ダイナミクスと細胞形状を可能にする生化学的手掛かりとして機能します。また、パターンをリアルタイムで容易に変更できるため、柔軟性も高くなります。ここでは、商用のマルチフォトンイメージングシステムを用いてマイクロフォトパターニングのステップバイステッププロトコルを提供する。記述されたプロトコルは大きいパターンの急速で自動化された製造のために設計されている。これらのパターンは、細胞-ECM接着の幾何学的形状を拘束することによって、細胞形状を効率的に制御することを実証した。最後に、記述されたパターン化技術がアクチン細胞骨格の組織とダイナミクスを調節することを実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記の結果は、記述されたIRレーザー支援マイクロパターン化(マイクロフォトパターン化)プロトコルが、細胞形状および細胞骨格アーキテクチャの操作を可能にする様々な形状の再現可能な付着パターンを提供することを示している。マイクロフォトパターニングのデビュー前と後の両方で多くのマイクロパターン化法が開発されてきたが、この方法には複数の利点がある。第一に、通常は…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、コノート基金の新調査官賞(S.P.、カナダイノベーション財団、NSERCディスカバリー補助金プログラム)(RGPIN-2015-05114とRGPIN-2020-05881)、マンチェスター大学とトロント大学共同研究基金、トロント大学XSeedプログラムによって支援されました。C.T.はNSERC USRAフェローシップによって支えられていました。
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
Riferimenti
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
- Inoué, S., Spring, K. R. . Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).
