イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング
Summary
ここでは、2光子顕微鏡を用いて生きているマウスの頭蓋骨の骨髄にメガカルヨサイトおよびプロ血小板をイメージングする方法について説明する。
Abstract
血小板は、骨髄に位置する特殊な細胞である巨核球によって産生される。メガカルヨサイトをリアルタイムで画像化する可能性とそのネイティブ環境は10年以上前に記述され、血小板形成のプロセスに新たな光を当てています。巨核球は、シヌソイド血管の内皮層を通して、プロ血滴と呼ばれる細長い突起を拡張する。本論文は、頭蓋骨骨髄およびサイヌシド血管において、蛍光標識された巨核球をリアルタイムで同時に画像化するプロトコルを提示する。この技術は、炎症反応を制限するために頭蓋骨をそのまま維持するマイナーな手術に依存しています。マウスの頭部は、呼吸の動きを防ぐために頭蓋骨に接着リングで固定化されています。
2光子顕微鏡を用いて、巨核球を最大数時間可視化することができ、細胞突起や原形の伸びの過程での細胞突起の観察が可能になります。これにより、突起の形態(幅、長さ、狭窄領域の存在)およびその伸び動作(速度、規則性、または一時停止または引き込みフェーズの存在)に関連するいくつかのパラメータを定量化することができます。この技術はまた、血小板速度および血流方向を決定するために、シヌソイド血管内の循環血小板の同時記録を可能にする。この方法は、遺伝子組み換えマウスを用いた血小板形成における関心遺伝子の役割を研究するのに特に有用であり、また、薬理学的検査(血小板産生障害の治療における薬剤の評価のメカニズムを研究する)にも適している。それは、インビボとインビトロプロ血小板形成が異なるメカニズムに依存することが知られているように、特にインビトロ研究を補完するために、非常に貴重なツールとなっています。例えば、体外微小管は、それらそれ以上の前小板伸長に必要とすることが示されている。しかし、生体内では足場として機能し、伸びは主に血流力によって促進される。
Introduction
血小板は、骨髄に位置する巨核球専門細胞によって産生される。巨核球が循環中の血小板を放出する正確な方法は、骨を通してリアルタイムの出来事を観察する際の技術的な課題のために長い間不明瞭なままであった。2光子顕微鏡はこの課題を克服し、血小板形成プロセスの理解において大きな進歩を遂げてきた。初の インビボ 巨核球観測は、2007年にフォン・アンドリアンらの研究グループによって行われ、頭蓋骨1を通して蛍光巨核球が可視化された。これは、若年成マウスの前頭蓋頭の骨層が数十ミクロンの厚さを有し、基礎となる骨髄2における蛍光細胞の可視化を可能にするのに十分に透明であるために可能であった。
続く研究では、様々な条件下でプロ血小板形成を評価し、基礎となるメカニズム3、4、5、6を解読するために、この手順を適用しました。これらの研究は、巨核球が、原形の血管の内皮的障壁を通って、プロ血小板と呼ばれる突起を動的に拡張するという決定的な証拠を提供した(図1)。これらのプロ血小板は、体積の数百の血小板を表す長い断片として放出される。血小板は、下流器官の微小循環におけるプロ血小板のリモデリング後、特に肺7に形成される。しかし、現在までに、正確なプロセスと分子メカニズムは議論の対象となっています。例えば、プロ血小板の伸びにおける細胞骨格タンパク質の提案された役割は、インビトロ条件とインビボ条件3の間で異なり、そして炎症条件下でプロ血小板形成の違いが実証されている6。さらに複雑なことに、最近の研究では、プロ血小板駆動の概念に異議を唱え、生体内では、巨核球レベル8の膜芽出機構を通して血小板が本質的に形成されることを提案した。
本論文は、生きているマウスの頭蓋骨から骨髄の巨核球およびプロ血小板を観察するためのプロトコルを、低侵襲的な手順を用いて提示する。同様のアプローチは、他の骨髄細胞、特に造血幹細胞および前駆細胞9を可視化するために先に説明されている。ここでの焦点は、測定できるいくつかのパラメータ、特にプロ血小板形態と血小板速度を詳述するために、巨核球および血小板の観察である。このプロトコルは、蛍光トレーサーと薬物を注入し、頭蓋骨を通して観察するために頸静脈にカテーテルを挿入する方法を提示します。小骨骨は、リングが骨に接着されるように、軽度の手術を使用して露出されます。このリングは、頭を固定化し、呼吸による動きを防ぎ、水中媒体として生理食音で満たされたカップを形成する役割を果たす。この技術はi)血管壁と相互作用するサイヌシド幾何学および巨核球をリアルタイムで観察するのに適している。ii) プロ血小板形成、伸び、および放出の過程で巨核球に従う;iii)血小板の動きを測定して、複雑なシヌサイド血流を監視する。このプロトコルを使用して取得したデータは最近公開されています3.
Protocol
Representative Results
Discussion
血小板形成のメカニズムは、骨髄環境に大きく依存しています。そのため、生体内顕微鏡は、リアルタイムでプロセスを可視化する分野で重要なツールとなっています。蛍光巨核球を有するマウスは、条件付き蛍光遺伝子発現カセットを含む任意のfloxedレポーターマウスと巨核球中のCreリコンビナーゼを発現するマウスを交流することによって得ることができる。ここで、mTmGレポーターマウ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、フロリアン・ガートナー(オーストリアのクロスターノイブルク科学技術研究所)に、私たちが実験室で技術を確立した当時の2光子顕微鏡実験に関する専門家のアドバイスと、イメージングセンターIGBMC /CBI(フランスのイキルヒ)のイヴ・ルッツの専門知識と2光子顕微鏡の助けに感謝したいと考えています。また、ジャン=イヴ・リンケルの技術的な助けと、イネス・ギナードのスキーマの描画に対して、図1に感謝します。ARMESA(2光子顕微鏡の獲得に向けた支援を受けたARMESA(メデシン・エ・サンテ・プブリケ協会)に感謝します。ABは、エタブリセ・フランセ・デュ・サン(APR2016)とアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ(ANR-18-CE14-0037-01)の博士研究員によって支えられました。
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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