In Vivo To-foton Imaging af Megakaryocytes og Proplatelets i Mouse Skull knoglemarv
Summary
Vi beskriver her metoden til billeddannelse megakaryocytter og proplatelets i marven af kraniet knogle af levende mus ved hjælp af to-foton mikroskopi.
Abstract
Blodplader produceres af megakaryocytter, specialiserede celler placeret i knoglemarven. Muligheden for at afbilde megakaryocytter i realtid og deres oprindelige miljø blev beskrevet for mere end 10 år siden og kaster nyt lys over blodpladedannelsesprocessen. Megakaryocytter strækker aflange fremspring, kaldet proplatelets, gennem endotelforingen af sinusoide fartøjer. Dette papir præsenterer en protokol til samtidig billede i realtid fluorescerende mærket megakaryocytter i kraniet knoglemarv og sinusoid fartøjer. Denne teknik er afhængig af en mindre operation, der holder kraniet intakt for at begrænse inflammatoriske reaktioner. Musehovedet er immobiliseret med en ring limet til kraniet for at forhindre bevægelser i at trække vejret.
Ved hjælp af to-fotonmikroskopi kan megakaryocytter visualiseres i op til et par timer, hvilket gør det muligt at observere cellefremspring og fremspring i processen med forlængelse inde i sinusoide fartøjer. Dette gør det muligt at kvantificere flere parametre relateret til morphology af fremspring (bredde, længde, tilstedeværelse af indsnævringsområder) og deres forlængelse adfærd (hastighed, regelmæssighed, eller tilstedeværelse af pauser eller tilbagetrækning faser). Denne teknik giver også mulighed for samtidig registrering af cirkulerende blodplader i sinusoide fartøjer til at bestemme blodplade hastighed og blodgennemstrømning retning. Denne metode er især nyttig til at studere den rolle, som gener af interesse i blodpladedannelse ved hjælp af genetisk modificerede mus og er også modtagelige for farmakologiske test (studere mekanismerne, evaluere lægemidler til behandling af blodpladeproduktionsforstyrrelser). Det er blevet et uvurderligt værktøj, især til at supplere in vitro-undersøgelser, da det nu er kendt, at in vivo og in vitro proplatelet dannelse er afhængige af forskellige mekanismer. Det har f.eks. vist sig, at der kræves in vitro-mikrotubuler til proplatelet-forlængelse i sig selv. Men in vivo, de snarere tjene som et stillads, forlængelse er primært fremmes af blodgennemstrømningen kræfter.
Introduction
Blodplader produceres af megakaryocytter-specialiserede celler placeret i knoglemarven. Den præcise måde megakaryocytter frigive blodplader i cirkulationen har længe været uklart på grund af den tekniske udfordring i at observere real-time begivenheder gennem knoglen. To-foton mikroskopi har hjulpet med at overvinde denne udfordring og førte til store fremskridt i forståelsen af blodplade dannelsesprocessen. De første in vivo megakaryocyt observationer blev foretaget af von Andrian og kolleger i 2007, med visualisering af fluorescerende megakaryocytter gennem kraniet1. Dette var muligt, fordi knoglelaget i frontoparietal kraniet af unge voksne mus har en tykkelse på et par snese mikron og er tilstrækkeligt gennemsigtig til at tillade visualisering af fluorescerende celler i den underliggende knoglemarv2.
Efterfølgende undersøgelser anvendte denne procedure til at evaluere proplateletdannelsen under forskellige betingelser og til at dechifrere de underliggende mekanismer3,4,5,6. Disse undersøgelser gav endelige beviser for, at megakaryocytter dynamisk udvider fremspring, kaldet proplatelets, gennem bihulebarrieren af sinusoide fartøjer (Figur 1). Disse proplatelets frigives derefter som lange fragmenter, der repræsenterer flere hundrede blodplader i volumen. Blodpladerne dannes efter ombygning af proplatelets i mikrocirkulationen af downstream-organer, især i lungerne7. Til dato er den præcise proces og molekylære mekanismer dog fortsat genstand for debat. For eksempel adskiller de cytoskeletale proteiners foreslåede rolle i forlængelsen af proplatelets mellem in vitro- og in vivo-forhold 3,og forskelle i proplateletdannelse er blevet påvist under inflammatoriske tilstande6. Komplicere tingene yderligere, en nylig undersøgelse bestridt proplatelet-drevet koncept og foreslog, at in vivo, blodplader er hovedsagelig dannet gennem en membran-spirende mekanisme på megakaryocyt niveau8.
Dette papir præsenterer en protokol til observation af megakaryocytter og proplatelets i knoglemarven fra kraniebenet i levende mus ved hjælp af en minimalt invasiv procedure. Lignende tilgange er tidligere blevet beskrevet for at visualisere andre marvceller, især hæmatoopoietiske stamceller og stamfaderceller9. Fokus her er på observation af megakaryocytter og blodplader til detaljer nogle parametre, der kan måles, især proplatelet morfologier og blodplade hastighed. Denne protokol præsenterer, hvordan man indsætter et kateter i halsvenen for at injicere fluorescerende sporstoffer og stoffer og observere gennem kraniebenet. Den calvariale knogle er udsat ved hjælp af mindre kirurgi, således at en ring er limet til knoglen. Denne ring tjener til at immobilisere hovedet og forhindre bevægelser på grund af vejrtrækning og danne en kop fyldt med saltvand som nedsænkning medium af linsen. Denne teknik er velegnet til i) observere i realtid sinusoid geometri og megakaryocytter interagere med fartøjet væggen; ii) følge megakaryocytter i processen med proplatelet dannelse, forlængelse, og frigivelse; og iii) måle blodplade bevægelser til at overvåge den komplekse sinusoid blodgennemstrømning. Data, der er indsamlet ved hjælp af denne protokol, er for nylig blevet offentliggjort3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismerne i blodpladedannelse er meget afhængige af knoglemarvsmiljøet. Derfor er intravital mikroskopi blevet et vigtigt værktøj i marken til at visualisere processen i realtid. Mus med fluorescerende megakaryocytter kan fås ved at krydse mus, der udtrykker Cre rekombininasen i megakaryocytter med eventuelle floxed reportermus, der indeholder en betinget fluorescerende genekspressionskassette. Her blev mTmG reporter mus brugt (B6.129 (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) krydset me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Østrig) for hans ekspertrådgivning om to-foton mikroskopi eksperimenter på det tidspunkt, hvor vi etablerede teknikken i laboratoriet, og Yves Lutz på Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Frankrig) for hans ekspertise og hjælp med to-foton mikroskop. Vi takker også Jean-Yves Rinkel for hans tekniske hjælp og Ines Guinard for tegningen af skemaet i figur 1. Vi takker ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) for dets støtte til erhvervelsen af mikroskopet to foton. AB blev støttet af ph.d.-stipendier fra Etablissement Français du Sang (APR2016) og fra Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Riferimenti
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
