वीवो में माउस खोपड़ी बोन मैरो में मेगाकैरियोसाइट्स और प्रोपलेट्स की दो फोटॉन इमेजिंग
Summary
हम यहां दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जीवित चूहों की खोपड़ी की हड्डी के मज्जा में मेगाकारियोसाइट्स और प्रोपलेट्स इमेजिंग के लिए विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
प्लेटलेट्स मेगाकारियोसाइट्स, अस्थि मज्जा में स्थित विशेष कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किए जाते हैं। वास्तविक समय में मेगाकारियोसाइट्स की छवि और उनके मूल वातावरण को 10 साल पहले वर्णित किया गया था और प्लेटलेट गठन की प्रक्रिया पर नई रोशनी डालता है। मेगाकारियोसाइट्स साइनसॉयड जहाजों की एंडोथेलियल अस्तर के माध्यम से विस्तारित फलाव का विस्तार करते हैं, जिन्हें प्रोपलेटलेट्स कहा जाता है। यह पेपर वास्तविक समय फ्लोरोसेंटी में एक साथ छवि के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो खोपड़ी बोन मैरो और साइनसॉइड जहाजों में मेगाकैरियोसाइट्स लेबल करता है। यह तकनीक एक छोटी सी सर्जरी पर निर्भर करती है जो भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए खोपड़ी को बरकरार रखती है। माउस सिर को सांस लेने से आंदोलनों को रोकने के लिए खोपड़ी से चिपकी अंगूठी के साथ स्थिर किया जाता है।
दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, मेगाकारियोसाइट्स को कुछ घंटों तक कल्पना की जा सकती है, जिससे साइनसॉयड जहाजों के अंदर विस्तार की प्रक्रिया में सेल फलाव और प्रोपलेटलेट के अवलोकन को सक्षम किया जा सकता है। यह फलाव (चौड़ाई, लंबाई, संकीर्तन क्षेत्रों की उपस्थिति) और उनके विस्तार व्यवहार (वेग, नियमितता, या ठहराव या पीछे हटने चरणों की उपस्थिति) की आकृति विज्ञान से संबंधित कई मापदंडों के मात्राकरण की अनुमति देता है। यह तकनीक प्लेटलेट वेग और रक्त प्रवाह की दिशा निर्धारित करने के लिए साइनसॉयड वाहिकाओं में परिसंचारी प्लेटलेट्स की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है। यह विधि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करके प्लेटलेट गठन में रुचि के जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और औषधीय परीक्षण (तंत्र का अध्ययन, प्लेटलेट उत्पादन विकारों के उपचार में दवाओं का मूल्यांकन) के लिए भी उत्तरदायी है। यह एक अमूल्य उपकरण बन गया है, विशेष रूप से इन विट्रो अध्ययनों के पूरक के रूप में अब यह ज्ञात है कि वीवो और इन विट्रो प्रॉपलेट गठन में विभिन्न तंत्रों पर भरोसा करते हैं। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि प्रति से प्रोपलेट विस्तार के लिए इन विट्रो माइक्रोट्यूबुल्स की आवश्यकता होती है। हालांकि, वीवो में,वे बल्कि एक पाड़ के रूप में काम करते हैं, मुख्य रूप से रक्त प्रवाह बलों द्वारा प्रचारित किया जा रहा है।
Introduction
प्लेटलेट्स बोन मैरो में स्थित मेगाकारियोसाइट्स-विशेष कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किए जाते हैं। सटीक तरीका है megakaryocytes संचलन में प्लेटलेट्स जारी लंबे समय हड्डी के माध्यम से वास्तविक समय की घटनाओं को देख में तकनीकी चुनौती के कारण अस्पष्ट बना हुआ है । दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी ने इस चुनौती से उबरने में मदद की है और प्लेटलेट गठन प्रक्रिया को समझने में बड़ी प्रगति हुई है । वीवो मेगाकार्योसाइट टिप्पणियों में पहला 2007 में वॉन एंड्रियन और सहयोगियों द्वारा किया गया था, जिसमें खोपड़ी1के माध्यम से फ्लोरोसेंट मेगाकैरियोसाइट्स का दृश्य था। यह इसलिए संभव हुआ क्योंकि युवा वयस्क चूहों की अग्रेतर खोपड़ी में हड्डी की परत में कुछ दसियों माइक्रोन की मोटाई होती है और यह अंतर्निहित अस्थि मज्जा2में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देने के लिए पर्याप्त पारदर्शी है ।
आगामी अध्ययनों ने विभिन्न परिस्थितियों में प्रोपलेट गठन का मूल्यांकन करने और अंतर्निहित तंत्र 3 , 4,5,6को समझने के लिए इस प्रक्रिया को लागू किया । इन अध्ययनों ने निश्चित सबूत प्रदान किए कि मेगाकारियोसाइट्स गतिशील रूप से साइनसॉयड जहाजों(चित्र 1)के एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से प्रोलेटलेट्स नामक प्रोट्रूस का विस्तार करते हैं। इन प्रोपलेटलेट्स को तब लंबे टुकड़ों के रूप में जारी किया जाता है जो मात्रा में कई सौ प्लेटलेट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्लेटलेट्स डाउनस्ट्रीम अंगों के माइक्रोसर्कुलेशन में प्रोपलेट्स के रीमॉडलिंग के बाद बनाए जाएंगे, खासकर फेफड़ों में7। लेकिन आज तक सटीक प्रक्रिया और आणविक तंत्र बहस के अधीन रहते हैं । उदाहरण के लिए, प्रोप्लेलेट्स के विस्तार में साइटोस्केलेटल प्रोटीन की प्रस्तावित भूमिका इन विट्रो और वीवो स्थितियों के बीच भिन्न होती है3, और प्रोलेटलेट गठन में अंतर भड़काऊ परिस्थितियों में प्रदर्शित किया गया है6. चीजों को और उलझी हुई, हाल ही में एक अध्ययन ने प्रोपलेट-चालित अवधारणा को विवादित किया और प्रस्ताव किया कि वीवो में,प्लेटलेट्स अनिवार्य रूप से मेगाकारियोसाइट स्तर8पर झिल्ली-नवोदित तंत्र के माध्यम से बनते हैं।
यह पेपर एक न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया का उपयोग करके जीवित चूहों में खोपड़ी की हड्डी से बोन मैरो में मेगाकैरियोसाइट्स और प्रोपलेटलेट्स के अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसी तरह के दृष्टिकोण पहले अन्य मज्जा कोशिकाओं, विशेष रूप से हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं9की कल्पना करने के लिए वर्णित किया गया है । यहां ध्यान मेगाकारियोसाइट्स और प्लेटलेट्स के अवलोकन पर है कि कुछ मापदंडों का विस्तार करने के लिए मापा जा सकता है, विशेष रूप से प्रोपलेट मॉर्फोलोजी और प्लेटलेट वेग । यह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कि फ्लोरोसेंट ट्रेसर और दवाओं को इंजेक्ट करने और खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से निरीक्षण करने के लिए जुगुलर नस में कैथेटर कैसे डालें। मामूली सर्जरी का उपयोग करके कैल्वरियल बोन सामने आ जाता है ताकि एक अंगूठी हड्डी से चिपकी हो। यह अंगूठी सिर को स्थिर करने और सांस लेने के कारण आंदोलनों को रोकने और लेंस के विसर्जन माध्यम के रूप में खारा से भरा एक कप बनाने के लिए कार्य करता है । यह तकनीक आई के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है) वास्तविक समय में साइनसॉइड ज्यामिति और मेगाकारियोसाइट्स पोत दीवार के साथ बातचीत करते हैं; ii) प्रोपलेटेलेट गठन, विस्तार और रिलीज की प्रक्रिया में मेगाकारियोसाइट्स का पालन करें; और iii) जटिल साइनसॉयड रक्त प्रवाह की निगरानी के लिए प्लेटलेट आंदोलनों को मापें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त आंकड़े हाल ही में प्रकाशित किए गए हैं3.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लेटलेट बनने के तंत्र बोन मैरो पर्यावरण पर अत्यधिक निर्भर हैं। इसलिए, वास्तविक समय में प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए क्षेत्र में इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है। फ्लोरोसे?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को फ्लोरियन Gaertner (विज्ञान और प्रौद्योगिकी संस्थान ऑस्ट्रिया, Klosterneuburg, ऑस्ट्रिया) समय पर दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगों पर अपनी विशेषज्ञ सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते है जब हम प्रयोगशाला में तकनीक की स्थापना की, और इमेजिंग सेंटर IGBMC में Yves Lutz/ हम जीन-येव्स रिंकल को उनकी तकनीकी मदद और आईएनएस गिनीर्ड को चित्र 1 में स्कीमा की ड्राइंग के लिए भी धन्यवाद देते हैं। हम दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण में इसके समर्थन के लिए एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक) को धन्यवाद देते हैं। एबी को एटब्लिसमेंट फ्रैंकैस डु सांग (APR2016) से और एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे (एएनआर-18-सीई14-0037-01) से पोस्ट-डॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Riferimenti
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
