In Vivo To-foton bildebehandling av Megakaryocytes og Proplatelets i Mus Skull Bone Marrow
Summary
Vi beskriver her metoden for avbildning av megakaryocytter og proplatelets i margen av skallebenet til levende mus ved hjelp av to-fotonmikroskopi.
Abstract
Blodplater er produsert av megakaryocytter, spesialiserte celler som ligger i benmargen. Muligheten til å avbilde megakaryocytter i sanntid og deres opprinnelige miljø ble beskrevet for mer enn 10 år siden og kaster nytt lys over prosessen med blodplatedannelse. Megakaryocytter strekker langstrakte fremspring, kalt proplater, gjennom endotelforingen av sinusoide kar. Dette papiret presenterer en protokoll for samtidig bilde i sanntid fluorescerende merket megakaryocytter i skallen benmarg og sinusoid fartøy. Denne teknikken er avhengig av en mindre kirurgi som holder skallen intakt for å begrense inflammatoriske reaksjoner. Musehodet er immobilisert med en ring limt til skallen for å forhindre bevegelser fra å puste.
Ved hjelp av to-fotonmikroskopi kan megakaryocytter visualiseres i opptil noen timer, noe som muliggjør observasjon av cellestikk og fremspring i forlengelsesprosessen inne i sinusoide kar. Dette tillater kvantifisering av flere parametere relatert til fremspringenes morfologi (bredde, lengde, tilstedeværelse av innsnevringsområder) og deres forlengelsesadferd (hastighet, regularitet eller tilstedeværelse av pauser eller tilbaketrekningsfaser). Denne teknikken tillater også samtidig registrering av sirkulerende blodplater i sinusoide kar for å bestemme blodplatehastighet og blodstrømsretning. Denne metoden er spesielt nyttig for å studere rollen til gener av interesse for blodplatedannelse ved hjelp av genetisk modifiserte mus og er også egnet til farmakologisk testing (studere mekanismene, evaluere legemidler i behandlingen av blodplateproduksjonsforstyrrelser). Det har blitt et uvurderlig verktøy, spesielt for å utfylle in vitro-studier, da det nå er kjent at in vivo og in vitro proplatelet formasjon er avhengige av forskjellige mekanismer. Det har for eksempel vist seg at in vitro mikrotubuler er nødvendig for proplatelet forlengelse i seg selv. Men in vivo, de tjener heller som stillas, forlengelse blir hovedsakelig fremmet av blodstrømskrefter.
Introduction
Blodplater produseres av megakaryocytter-spesialiserte celler som ligger i benmargen. Den nøyaktige måten megakaryocytter frigjør blodplater i sirkulasjonen har lenge vært uklar på grunn av den tekniske utfordringen med å observere sanntidshendelser gjennom beinet. To-fotonmikroskopi har bidratt til å overvinne denne utfordringen og ført til store fremskritt i forståelsen av blodplatedannelsesprosessen. De første in vivo megakaryocyte observasjonene ble gjort av von Andrian og kolleger i 2007, med visualisering av fluorescerende megakaryocytter gjennom skallen1. Dette var mulig fordi beinlaget i frontoparietal skallen til unge voksne mus har en tykkelse på noen få titalls mikroner og er tilstrekkelig gjennomsiktig til å tillate visualisering av fluorescerende celler i underliggende benmarg2.
Påfølgende studier anvendte denne prosedyren for å evaluere proplateletdannelse under ulike forhold og for å dechiffrere de underliggende mekanismene3,4,5,6. Disse studiene ga definitive bevis på at megakaryocytter dynamisk forlenger fremspring, kalt fremspring, gjennom endotelbarrieren til sinusoidfartøyene (figur 1). Disse proplatelets frigjøres deretter som lange fragmenter som representerer flere hundre blodplater i volum. Blodplater vil bli dannet etter ombygging av proplater i mikrosirkulasjonen av nedstrøms organer, spesielt i lungene7. Til dags dato er imidlertid de presise prosess- og molekylære mekanismene fortsatt gjenstand for debatt. For eksempel er den foreslåtte rollen til cytoskeletale proteiner i forlengelsen av proplater forskjellig mellom in vitro og in vivo forhold3, og forskjeller i proplateletdannelse har blitt demonstrert under inflammatoriske forhold6. Kompliserer ting videre, en nylig studie omstridte det proplatelet-drevne konseptet og foreslo at in vivo, blodplater er i hovedsak dannet gjennom en membran-spirende mekanisme på megakaryocytt nivå8.
Dette papiret presenterer en protokoll for observasjon av megakaryocytter og proplater i benmargen fra skallebenet hos levende mus, ved hjelp av en minimal invasiv prosedyre. Lignende tilnærminger har tidligere blitt beskrevet for å visualisere andre margceller, spesielt hematopoietisk stamme og stamceller9. Fokuset her er på observasjon av megakaryocytter og blodplater for å detaljere noen parametere som kan måles, spesielt proplatelet morfologier og blodplatehastighet. Denne protokollen presenterer hvordan du setter inn et kateter i jugularvenen for å injisere fluorescerende sporstoffer og stoffer og observere gjennom skallebenet. Calvarialbenet utsettes ved hjelp av mindre kirurgi slik at en ring limes til beinet. Denne ringen tjener til å immobilisere hodet og forhindre bevegelser på grunn av pust og danne en kopp fylt med saltvann som linsens nedsenkningsmedium. Denne teknikken er godt egnet til i) observere i sanntid sinusoid geometri og megakaryocytter samhandler med karveggen; ii) følge megakaryocytter i prosessen med proplateletdannelse, forlengelse og frigjøring; og iii) måle blodplatebevegelser for å overvåke den komplekse sinusoide blodstrømmen. Data som er hentet ved hjelp av denne protokollen, er nylig publisert3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismene for blodplatedannelse er svært avhengige av benmargsmiljøet. Derfor har intravital mikroskopi blitt et viktig verktøy i feltet for å visualisere prosessen i sanntid. Mus med fluorescerende megakaryocytter kan oppnås ved å krysse mus som uttrykker Cre-rekombinene i megakaryocytter med noen floxed reportermus som inneholder en betinget fluorescerende genuttrykkskassett. Her ble mTmG reportermus brukt (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) krysset med Pf4-cre mus<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Østerrike) for hans ekspertråd om tofotonmikroskopieksperimenter på den tiden da vi etablerte teknikken i laboratoriet, og Yves Lutz ved IMAGING Center IGBMC / CBI (Illkirch, Frankrike) for sin ekspertise og hjelp med det tofotoniske mikroskopet. Vi takker også Jean-Yves Rinkel for hans tekniske hjelp og Ines Guinard for tegningen av skjemaet i figur 1. Vi takker ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) for støtten til oppkjøpet av det to-fotoniske mikroskopet. AB ble støttet av postdoktorstipend fra Etablissement Français du Sang (APR2016) og fra Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Riferimenti
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
