Здесь описан метод визуализации мегакариоцитов и проплацетов в костном мозге черепа живых мышей с помощью двухфотонной микроскопии.
Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами, специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Возможность изображения мегакариоцитов в режиме реального времени и их родной среды была описана более 10 лет назад и проливает новый свет на процесс образования тромбоцитов. Мегакариоциты распространяются на удлиненные протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальную выстилку синусоидальных сосудов. В данной работе представлен протокол для одновременного изображения в режиме реального времени флуоресцентно меченых мегакариоцитов в костном мозге черепа и синусоидальных сосудах. Этот метод основан на незначительной операции, которая сохраняет череп нетронутым, чтобы ограничить воспалительные реакции. Голова мыши обездвижена кольцом, приклеенным к черепу, чтобы предотвратить движения от дыхания.
С помощью двухфотонной микроскопии мегакариоциты можно визуализировать на срок до нескольких часов, что позволяет наблюдать клеточные протрузии и проplatelets в процессе удлинения внутри синусоидальных сосудов. Это позволяет количественно оценить несколько параметров, связанных с морфологией выступов (ширина, длина, наличие сужающих областей) и их поведением удлинения (скорость, регулярность или наличие пауз или фаз втягивания). Этот метод также позволяет одновременно регистрировать циркулирующие тромбоциты в синусоидальных сосудах для определения скорости тромбоцитов и направления кровотока. Этот метод особенно полезен для изучения роли генов, представляющих интерес, в образовании тромбоцитов с использованием генетически модифицированных мышей, а также поддался фармакологической проверке (изучению механизмов, оценке препаратов при лечении нарушений выработки тромбоцитов). Он стал бесценным инструментом, особенно для дополнения исследований in vitro, поскольку теперь известно, что образование проплатлетов in vivo и in vitro зависит от разных механизмов. Было показано, например, что микротрубочки in vitro необходимы для удлинения проплатлетов как такового. Однако in vivoони скорее служат каркасом, удлинению которого в основном способствуют силы кровотока.
Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами – специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Точный способ высвобождения мегакариоцитами тромбоцитов в циркуляции долгое время оставался неясным из-за технической проблемы в наблюдении событий в реальном времени через кость. Двухфотонная микроскопия помогла преодолеть эту проблему и привела к значительным достижениям в понимании процесса образования тромбоцитов. Первые наблюдения in vivo мегакариоцитов были сделаны фон Андрианом и его коллегами в 2007 году с визуализацией флуоресцентных мегакариоцитов через череп1. Это стало возможным благодаря тому, что костный слой в лобно-париетальном черепе молодых взрослых мышей имеет толщину в несколько десятков микрон и достаточно прозрачен, чтобы позволить визуализацию флуоресцентных клеток в нижележащего костном мозге2.
Последующие исследования применяли эту процедуру для оценки образования проплацирования в различных условиях и для расшифровки основных механизмов3,4,5,6. Эти исследования предоставили окончательные доказательства того, что мегакариоциты динамически расширяют протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальный барьер синусоидальных сосудов(рисунок 1). Эти пластинки затем высвобождаются в виде длинных фрагментов, которые представляют собой несколько сотен тромбоцитов в объеме. Тромбоциты будут образовываться после ремоделирования проплацетов в микроциркуляции нижестоящих органов, особенно в легких7. Однако на сегодняшний день точный процесс и молекулярные механизмы остаются предметом дискуссий. Например, предложенная роль цитоскелетных белков в удлинении проплацет различается между условиями in vitro и in vivo 3,и различия в образовании проплацелетов были продемонстрированы в воспалительных состояниях6. Еще больше усложняет ситуацию недавнее исследование, оспаривающее концепцию, управляемую проплатлетами, и предположило, что in vivoтромбоциты по существу образуются через механизм мембранного почкования на уровне мегакариоцитов8.
В данной работе представлен протокол наблюдения за мегакариоцитами и проплацелетами в костном мозге из кости черепа у живых мышей, с использованием малоинвазивной процедуры. Подобные подходы были ранее описаны для визуализации других клеток костного мозга, в частности гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток9. Основное внимание здесь уделяется наблюдению за мегакариоцитами и тромбоцитами для детализации некоторых параметров, которые могут быть измерены, в частности морфологии проплатлетов и скорости тромбоцитов. В этом протоколе представлено, как вставить катетер в яремную вену для введения флуоресцентных индикаторов и лекарств и наблюдения через кость черепа. Кальвариальная кость подвергается воздействию с помощью незначительной хирургии, так что кольцо приклеивается к кости. Это кольцо служит для обездвиживания головы и предотвращения движений из-за дыхания и образует чашку, наполненную физиологическим раствором в качестве погружной среды хрусталика. Эта методика хорошо подходит для i) наблюдения в режиме реального времени синусоидальной геометрии и мегакариоцитов, взаимодействующих со стенкой сосуда; ii) следить за мегакариоцитами в процессе образования, удлинения и высвобождения проплацирования; и iii) измерять движения тромбоцитов для мониторинга сложного синусоидального кровотока. Данные, полученные с помощью этого протокола, были недавно опубликованы3.
Механизмы образования тромбоцитов сильно зависят от среды костного мозга. Следовательно, прижизальная микроскопия стала важным инструментом в полевых условиях для визуализации процесса в режиме реального времени. Мыши с флуоресцентными мегакариоцитами могут быть получены путем скр…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Флориана Гертнера (Институт науки и техники Австрии, Клостернойбург, Австрия) за его экспертные советы по экспериментам с двухфотонной микроскопией в то время, когда мы установили технику в лаборатории, и Ива Лутца в Центре визуализации IGBMC / CBI (Илькирх, Франция) за его опыт и помощь с двухфотонным микроскопом. Мы также благодарим Жана-Ива Ринкеля за его техническую помощь и Инес Гинард за рисование схемы на рисунке 1. Мы благодарим ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) за поддержку в приобретении двухфотонного микроскопа. AB был поддержан постдокторскими стипендиями от Etablissement Français du Sang (APR2016) и от Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |