In Vivo Två-foton imaging av Megakaryocytes och Proplatelets i musskalle benmärgen
Summary
Vi beskriver här metoden för avbildning megakaryocyter och proplatelets i märgen av skallbenet av levande möss med hjälp av två-fotonmikroskopi.
Abstract
Trombocyter produceras av megakaryocyter, specialiserade celler som ligger i benmärgen. Möjligheten att avbilda megakaryocyter i realtid och deras inhemska miljö beskrevs för mer än 10 år sedan och kastar nytt ljus över processen med trombocytbildning. Megakaryocyter sträcker sig långsträckta utskjutningar, så kallade proplatelets, genom endotelfoder av sinusoidkärl. Detta dokument presenterar ett protokoll för att samtidigt avbilda i realtid fluorescerande märkta megakaryocyter i skalle benmärg och sinusoid fartyg. Denna teknik förlitar sig på en mindre operation som håller skallen intakt för att begränsa inflammatoriska reaktioner. Mushuvudet är immobiliserat med en ring limmad vid skallen för att förhindra att rörelser andas.
Med hjälp av två-fotonmikroskopi kan megakaryocyter visualiseras i upp till några timmar, vilket möjliggör observation av cellutskjutningar och proplatelets i förlängningsprocessen inuti sinusoidkärl. Detta möjliggör kvantifiering av flera parametrar relaterade till utskjutningens morfologi (bredd, längd, närvaro av förträngningsområden) och deras förlängningsbeteende (hastighet, regelbundenhet eller närvaro av pauser eller upprullningsfaser). Denna teknik tillåter också samtidig registrering av cirkulerande trombocyter i sinusoidkärl för att bestämma trombocythastighet och blodflödesriktning. Denna metod är särskilt användbar för att studera rollen hos gener av intresse för trombocytbildning med genetiskt modifierade möss och är också mottaglig för farmakologisk testning (studera mekanismerna, utvärdera läkemedel vid behandling av trombocytproduktionsstörningar). Det har blivit ett ovärderligt verktyg, särskilt för att komplettera in vitro-studier eftersom det nu är känt att in vivo- och in vitroproplateletbildning förlitar sig på olika mekanismer. Det har till exempel visat sig att in vitro-mikrotubuler krävs för proplateletförlängning i sig. Men in vivo, de fungerar snarare som en byggnadsställning, förlängning främjas främst av blodflödeskrafter.
Introduction
Trombocyter produceras av megakaryocyter-specialiserade celler som ligger i benmärgen. Det exakta sättet megakaryocyter släpper trombocyter i cirkulationen har länge varit oklart på grund av den tekniska utmaningen att observera realtidshändelser genom benet. Två-fotonmikroskopi har hjälpt till att övervinna denna utmaning och lett till stora framsteg i förståelsen av trombocytbildningsprocessen. De första in vivo megakaryocyte observationer gjordes av von Andrian och kollegor i 2007, med visualisering av fluorescerande megakaryocyter genom skallen1. Detta var möjligt eftersom benskiktet i den främre skallen av unga vuxna möss har en tjocklek på några tiotals mikron och är tillräckligt transparent för att möjliggöra visualisering av fluorescerande celler i den underliggande benmärgen2.
Följande studier tillämpade detta förfarande för att utvärdera proplateletbildning under olika förhållanden och för att dechiffrera de underliggandemekanismerna 3,4,5,6. Dessa studier gav definitiva bevis för att megakaryocyter dynamiskt förlänger utskjutande delar, så kallade proplatelets, genom endotelbarriären hos sinusoidkärlen (figur 1). Dessa proplatelets frigörs sedan som långa fragment som representerar flera hundra trombocyter i volym. Trombocyterna kommer att bildas efter ombyggnad av proplatelets i mikrocirkulationen av nedströms organ, särskilt i lungorna7. Hittills är dock den exakta processen och molekylära mekanismerna fortfarande föremål för debatt. Till exempel skiljer sig den föreslagna rollen av cytoskeletala proteiner i förlängningen av proplatelets mellan in vitro och in vivo villkor3, och skillnader i proplatelet bildas har visats under inflammatoriska förhållanden6. Komplicera saker ytterligare, en ny studie ifrågasatte det proplateletdrivna konceptet och föreslog att in vivo, trombocyter bildas i huvudsak genom en membran-spirande mekanism på megakaryocyt nivå8.
Detta dokument presenterar ett protokoll för observation av megakaryocyter och proplatelets i benmärgen från skallbenet hos levande möss, med hjälp av ett minimalt invasivt förfarande. Liknande metoder har tidigare beskrivits för att visualisera andra märgceller, särskilt hematopoetiska stam- och stamceller9. Fokus här ligger på observation av megakaryocyter och trombocyter för att beskriva några parametrar som kan mätas, särskilt proplatelet morfologier och trombocythastighet. Detta protokoll presenterar hur man sätter in en kateter i halsvenen för att injicera fluorescerande spårämnen och droger och observera genom skallbenet. Calvarialbenet exponeras med mindre kirurgi så att en ring limmas fast vid benet. Denna ring tjänar till att immobilisera huvudet och förhindra rörelser på grund av andning och bilda en kopp fylld med saltlösning som linsens nedsänkningsmedium. Denna teknik är väl lämpad för i) observera i realtid sinusoidgeometri och megakaryocyter som interagerar med kärlväggen; ii) följa megakaryocyter i processen för proplateletbildning, förlängning och frisättning; och iii) mäta trombocytrörelser för att övervaka det komplexa sinusoidblodflödet. Data som erhållits med det här protokollet har nyligen publicerats3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismerna för trombocytbildning är mycket beroende av benmärgsmiljön. Därför har intravital mikroskopi blivit ett viktigt verktyg inom området för att visualisera processen i realtid. Möss med fluorescerande megakaryocyter kan erhållas genom att korsa möss som uttrycker Cre rekombinas i megakaryocyter med alla floxed reporter möss som innehåller en villkorlig fluorescerande genuttryck kassett. Här användes mTmG-reportermöss (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)kors…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Florian Gaertner (Institute of Science and Technology Austria, Klosterneuburg, Österrike) för hans expertråd om två-fotonmikroskopiexperiment vid den tidpunkt då vi etablerade tekniken i labbet och Yves Lutz vid Imaging Center IGBMC / CBI (Illkirch, Frankrike) för hans expertis och hjälp med två-fotonmikroskopet. Vi tackar också Jean-Yves Rinkel för hans tekniska hjälp och Ines Guinard för ritningen av schemat i figur 1. Vi tackar ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) för dess stöd vid förvärvet av två-fotonmikroskopet. AB fick stöd av postdoktorala stipendier från Etablissement Français du Sang (APR2016) och från Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Riferimenti
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
