Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.
Trombositler, kemik iliğinde bulunan özel hücreler olan megakaryositler tarafından üretilir. Megakaryositleri gerçek zamanlı olarak ve doğal ortamlarında görüntüleme imkanı 10 yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış ve trombosit oluşum sürecine yeni bir ışık tutmaktadır. Megakaryositler, sinüzoid damarların endotel astarı yoluyla proplatlet adı verilen uzun çıkıntıları uzatır. Bu makale, kafatası kemik iliği ve sinüzoid damarlardaki gerçek zamanlı floresan etiketli megakaryositlerde aynı anda görüntü vermek için bir protokol sürmektedir. Bu teknik, enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kafatasını sağlam tutan küçük bir ameliyata dayanır. Fare kafası, hareketlerin nefes almasını önlemek için kafatasına yapıştırılmış bir halka ile hareketsiz hale getirilir.
İki fotonlu mikroskopi kullanılarak, megakaryositler birkaç saate kadar görselleştirilerek sinüzoid damarların içindeki uzama sürecinde hücre çıkıntılarının ve proplatletlerin gözlemlenmesi sağlanabilir. Bu, çıkıntıların morfolojisi (genişlik, uzunluk, daralma alanlarının varlığı) ve uzama davranışları (hız, düzenlilik veya duraklama veya geri çekme aşamalarının varlığı) ile ilgili çeşitli parametrelerin ölçülmesine izin verir. Bu teknik aynı zamanda trombosit hızını ve kan akışı yönünü belirlemek için sinüzoid damarlarda dolaşan trombositlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem özellikle genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak trombosit oluşumunda ilgi çekici genlerin rolünü incelemek için yararlıdır ve farmakolojik testlere de açıktır (mekanizmaları inceleyin, trombosit üretim bozukluklarının tedavisinde ilaçları değerlendirin). In vivo ve in vitro proplatlet oluşumunun farklı mekanizmalara dayandığı bilindiği için özellikle in vitro çalışmaları tamamlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, proplatlet uzaması için in vitro mikrotübüllerin gerekli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, in vivo, esas olarak kan akış kuvvetleri tarafından teşvik edilen bir iskele olarak hizmet ederler.
Trombositler kemik iliğinde bulunan megakaryositlere özel hücreler tarafından üretilir. Megakaryositlerin dolaşımdaki trombositleri serbest bırakmasının kesin yolu, kemikten gerçek zamanlı olayları gözlemlemedeki teknik zorluk nedeniyle uzun süre belirsiz kalmıştır. İki fotonlu mikroskopi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı oldu ve trombosit oluşum sürecini anlamada büyük ilerlemelere yol açtı. İlk in vivo megakaryosit gözlemleri 2007 yılında von Andrian ve meslektaşları tarafından yapıldı, floresan megakaryositlerin kafatasından görselleştirilmesiile 1. Bu mümkündü, çünkü genç yetişkin farelerin frontoparietal kafatasındaki kemik tabakası birkaç on mikron kalınlığa sahiptir ve alttaki kemik iliğindeki floresan hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için yeterinceşeffaftır 2.
Daha sonra yapılan çalışmalarda proplatelet oluşumunun çeşitli koşullar altında değerlendirilmesi ve alttaki mekanizmaların deşifre edilmesi için 3 ,4,5,6. Bu çalışmalar, megakaryositlerin proplatlet adı verilen çıkıntıları sinüzoid damarların endotel bariyeri yoluyla dinamik olarak genişlettiklerine dair kesin kanıtlar sağlamıştır(Şekil 1). Bu proplateletler daha sonra hacim olarak birkaç yüz trombosit temsil eden uzun parçalar olarak serbest bırakılır. Trombositler, özellikle akciğerlerde olmak üzere aşağı akış organlarının mikrosirkülasyonunda proplateletlerin yeniden şekillendirilmesinden sonra oluşacaktır7. Ancak bugüne kadar kesin süreç ve moleküler mekanizmalar tartışılmaya devam etmektedir. Örneğin, sitoskeletal proteinlerin proplatletlerin uzamasındaki önerilen rolü in vitro ve in vivo koşullar arasında farklılık gösterir3ve proplatlet oluşumundaki farklılıklar enflamatuar koşullar altında gösterilmiştir6. İşleri daha da karmaşık hale getiren, yeni bir çalışma proplatelet güdümlü konsepte itiraz etti ve in vivo, trombositlerin esasen megakaryosit seviyesinde bir membran tomurcuklama mekanizması ile oluştur olduğunu önerdi8.
Bu makale, canlı farelerde kafatası kemiğinden kemik iliğindeki megakaryositlerin ve proplatletlerin minimal invaziv bir prosedür kullanılarak gözlemlenmesi için bir protokol sunun. Benzer yaklaşımlar daha önce hematopoetik kök ve progenitör hücreler başta olmak üzere diğer ilik hücrelerini görselleştirmek içintanımlanmıştır 9. Burada, özellikle proplatlet morfolojileri ve trombosit hızı olmak üzere ölçülebilen bazı parametreleri detaylandırmak için megakaryositlerin ve trombositlerin gözlemlenmesi üzerinde durulmaktadır. Bu protokol, floresan izleyiciler ve ilaçlar enjekte etmek ve kafatası kemiğinden gözlemlemek için şahdamarına bir kateterin nasıl yerleştirılacağını sunar. Kalvarial kemik küçük bir ameliyat kullanılarak maruz kalır, böylece kemiğe bir halka yapıştırılır. Bu halka, başı hareketsiz hale getirmek ve nefes almaya bağlı hareketleri önlemek ve lensin daldırma ortamı olarak tuzlu su dolu bir bardak oluşturmak için hizmet eder. Bu teknik i) sinüsoid geometrisini ve damar duvarı ile etkileşime giren megakaryositleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için çok uygundur; ii) proplatlet oluşumu, uzama ve salınım sürecinde megakaryositleri takip edin; ve iii) karmaşık sinüzoid kan akışını izlemek için trombosit hareketlerini ölçmek. Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler yakın zamanda yayımlanmıştır3.
Trombosit oluşum mekanizmaları kemik iliği ortamına oldukça bağlıdır. Bu nedenle intravital mikroskopi, süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için sahada önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan megakaryositli fareler, Cre rekombinazını megakaryositlerde ifade eden fareleri koşullu floresan gen ifade kaseti içeren herhangi bir floxed muhabir fare ile geçerek elde edilebilir. Burada, mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10</em…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, laboratuvarda tekniği kurduğumuz dönemde iki fotonlu mikroskopi deneyleri konusundaki uzman tavsiyeleri için Florian Gaertner’e (Avusturya Bilim ve Teknoloji Enstitüsü), IGBMC /CBI Görüntüleme Merkezi’ndeki (Illkirch, Fransa) Yves Lutz’a ise uzmanlığı ve iki foton mikroskobu konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Ayrıca jean-Yves Rinkel’e teknik yardımı için ve Ines Guinard’a şekil 1’deki şemanın çizimi için teşekkür ederiz. ARMESA’ya (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) iki foton mikroskobun satın alınmasındaki desteği için teşekkür ederiz. AB, Etablissement Français du Sang (APR2016) ve Agence Nationale de la Recherche’den (ANR-18-CE14-0037-01) doktora sonrası burslarla desteklendi.
GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |