Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo
Summary
Este protocolo descreve a extração de compostos orgânicos voláteis de uma amostra biológica com o método de extração sorbent assistido a vácuo, cromatografia gasosa juntamente com espectrometria de massa usando o Entech Sample Preparation Rail e análise de dados. Também descreve a cultura de amostras biológicas e sondagem de isótopos estáveis.
Abstract
Compostos orgânicos voláteis (VOCs) de amostras biológicas têm origens desconhecidas. Os VOCs podem se originar do hospedeiro ou de diferentes organismos de dentro da comunidade microbiana do hospedeiro. Para desembaraçar a origem dos VOCs microbianos, foram realizadas análises voláteis do espaço da cabeça de monoculturas bacterianas e co-culturas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, e testes estáveis de isótopos em amostras biológicas de fezes, saliva, esgoto e espito. Monoculturas foram utilizadas para identificar a produção volátil de espécies bacterianas individuais ou em combinação com a sondagem de isótopos estáveis para identificar o metabolismo ativo dos micróbios das amostras biológicas.
A extração sorbent assistida a vácuo (VASE) foi empregada para extrair os VOCs. O VASE é um método de extração de espaço livre de solventes fácil de usar, comercializado e livre de solventes para compostos semi-voláteis e voláteis. A falta de solventes e as condições de quase vácuo utilizadas durante a extração tornam o desenvolvimento de um método relativamente fácil e rápido quando comparado a outras opções de extração, como tert-butylation e microextração de fase sólida. O fluxo de trabalho descrito aqui foi usado para identificar assinaturas voláteis específicas de mono-e co-culturas. Além disso, a análise da sondagem estável de isótopos de amostras biológicas associadas humanas identificou CODs comumente ou exclusivamente produzidos. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho geral e considerações experimentais do VASE em conjunto com a sondagem estável de culturas microbianas vivas.
Introduction
Compostos orgânicos voláteis (VOCs) têm grande promessa de detecção e identificação bacteriana porque são emitidos de todos os organismos, e diferentes micróbios têm assinaturas exclusivas de VOC. Moléculas voláteis têm sido utilizadas como uma medida não invasiva para a detecção de várias infecções respiratórias, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica1, tuberculose2 na urina3 e pneumonia associada ao ventilador4, além de distinguir indivíduos com fibrose cística (CF) de indivíduos de controle saudável 5,6. Assinaturas voláteis têm sido usadas até mesmo para distinguir infecções específicas de patógenos em CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). No entanto, com a complexidade dessas amostras biológicas, muitas vezes é difícil identificar a fonte de VOCs específicos.
Uma estratégia para desembaraçar os perfis voláteis de micróbios infecciosos múltiplos é realizar a análise do espaço da cabeça de microrganismos tanto na mono-quanto na cocultura11. A análise do headspace examina os analitos emitidos no “headspace” acima de uma amostra em vez daqueles incorporados na própria amostra. Metabólitos microbianos têm sido frequentemente caracterizados em monoculturas devido à dificuldade em determinar a origem dos metabólitos microbianos em amostras clínicas complexas. Ao traçar perfis voláteis de monoculturas bacterianas, os tipos de voláteis que um micróbio produz in vitro podem representar uma linha de base de seu repertório volátil. A combinação de culturas bacterianas, por exemplo, a criação de co-culturas e o perfil das moléculas voláteis produzidas podem revelar as interações ou a alimentação cruzada entre as bactérias12.
Outra estratégia para identificar a origem microbiana de moléculas voláteis é fornecer uma fonte de nutrientes que é rotulada com um isótopo estável. Isótopos estáveis são formas não radioativas de átomos com um número diferente de nêutrons. Em uma estratégia que vem sendo utilizada desde o início da década de 1930 para traçar o metabolismo ativo em animais13, o microrganismo se alimenta da fonte de nutrientes rotulado e incorpora o isótopo estável em suas vias metabólicas. Mais recentemente, um isótopo estável na forma de água pesada (D2O) tem sido usado para identificar S. aureus metabolicamente ativo em uma amostra clínica de escarro CF14. Em outro exemplo, a glicose com 13C foi usada para demonstrar a alimentação cruzada de metabólitos entre os isolados clínicos cf de P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Com o avanço das técnicas de espectrometria de massa, os métodos de detecção de pistas voláteis passaram de observações qualitativas para medidas mais quantitativas. Usando espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), o processamento de amostras biológicas tornou-se ao alcance da maioria dos ambientes laboratoriais ou clínicos. Muitos métodos para levantamento de moléculas voláteis têm sido usados para traçar o perfil de amostras como alimentos, culturas bacterianas e outras amostras biológicas, e ar e água para detectar contaminação. No entanto, vários métodos comuns de amostragem volátil com alto rendimento exigem solvente e não são realizados com as vantagens proporcionadas pela extração a vácuo. Além disso, volumes ou quantidades maiores (superiores a 0,5 mL) de materiais amostrados são frequentemente necessários para análisede 15,16,17,18,19, embora isso seja específico do substrato e exija otimização para cada tipo e método de amostra.
Aqui, a extração sorbent assistida a vácuo (VASE) seguida de desorção térmica em um GC-MS foi empregada para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e coculturas e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro (Figura 1). Com quantidades amostrais limitadas, os VOCs foram extraídos de apenas 15 μL de escarro. Experimentos de sondagem de isótopos com amostras humanas exigiram a adição de uma fonte estável de isótopos, como glicose de 13C, e mídia para cultivar o crescimento da comunidade microbiana. A produção ativa de voláteis foi identificada como uma molécula mais pesada pelo GC-MS. A extração de moléculas voláteis sob um vácuo estático permitiu a detecção de moléculas voláteis com maior sensibilidade 20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para identificar a produção volátil em culturas in vitro e amostras associadas ao homem, foram realizadas análises voláteis de monoculturas de P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e isótopos estáveis de diferentes amostras biológicas. Na análise para as monoculturas e coculturas, os voláteis foram detectados realizando uma extração curta por 1h a 70 °C. A análise volátil das monoculturas e coculturas permitiu o levantamento dos compostos produzidos tanto por espécies individu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Heather Maughan e Linda M. Kalikin pela edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
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