Моделирование инсульта у мышей: транзиторная окклюзия средней мозговой артерии через наружную сонную артерию
Summary
Различные модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) используются в экспериментальных исследованиях инсульта. Здесь описана экспериментальная модель инсульта транзиторного MCAo через наружную сонную артерию (ECA), целью которой является имитация инсульта человека, при котором цереброваскулярный тромб удаляется из-за спонтанного лизиса сгустка или терапии.
Abstract
Инсульт является третьей наиболее распространенной причиной смертности и основной причиной приобретенной инвалидности взрослых в развитых странах. На сегодняшний день терапевтические возможности ограничены небольшой долей пациентов с инсультом в течение первых часов после инсульта. Новые терапевтические стратегии широко исследуются, особенно для продления терапевтического временного окна. Эти текущие исследования включают изучение важных патофизиологических путей после инсульта, таких как постинсультное воспаление, ангиогенез, пластичность нейронов и регенерация. В последнее десятилетие растет обеспокоенность по поводу плохой воспроизводимости экспериментальных результатов и научных результатов среди независимых исследовательских групп. Для преодоления так называемого «кризиса репликации» срочно необходимы подробные стандартизированные модели для всех процедур. В рамках исследовательского консорциума «ImmunoStroke» (https://immunostroke.de/) предложена стандартизированная мышиная модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (MCAo). Эта модель позволяет полностью восстановить кровоток при удалении нити, имитируя терапевтический или спонтанный лизис сгустка, который происходит при значительной части инсультов человека. Хирургическая процедура этой модели инсульта «нити» и инструменты для ее функционального анализа демонстрируются в сопроводительном видео.
Introduction
Инсульт является одной из наиболее распространенных причин смерти и инвалидности во всем мире. Хотя существует в основном две различные формы инсульта, ишемическая и геморрагическая, 80-85% всех случаев инсульта являются ишемическими1. В настоящее время для пациентов с ишемическим инсультом доступны только два метода лечения: фармакологическое лечение активатором рекомбинантного тканевого плазминогена (rtPA) или механическая тромбэктомия. Однако из-за узкого терапевтического временного окна и нескольких критериев исключения только избранное число пациентов может извлечь выгоду из этих конкретных вариантов лечения. За последние два десятилетия доклинические и трансляционные исследования инсульта были сосредоточены на изучении нейропротекторных подходов. Тем не менее, все соединения, которые достигли клинических испытаний, до сих пор не показали никаких улучшений для пациента2.
Поскольку модели in vitro не могут точно воспроизвести все взаимодействия мозга и патофизиологические механизмы инсульта, животные модели имеют решающее значение для доклинических исследований инсульта. Однако имитация всех аспектов ишемического инсульта человека на одной животной модели невозможна, поскольку ишемический инсульт является очень сложным и гетерогенным заболеванием. По этой причине различные модели ишемического инсульта были разработаны с течением времени у разных видов. Фототромбоз артериол головного мозга или постоянная дистальная окклюзия средней мозговой артерии (MCA) являются широко используемыми моделями, которые индуцируют небольшие и локально определяемые поражения в неокортексе3,4. Кроме того, наиболее часто используемой моделью инсульта, вероятно, является так называемая «модель нити», в которой достигается преходящая окклюзия MCA. Данная модель состоит из преходящего введения шовной нити к источнику МКА, приводящего к резкому снижению мозгового кровотока и последующему большому инфаркту подкорковой и корковой областей мозга5. Хотя большинство моделей инсульта имитируют окклюзии MCA 6,«модель нити» позволяет точно разграничить ишемическое время. Реперфузия путем удаления нити имитирует клинический сценарий восстановления мозгового кровотока человека после спонтанного или терапевтического (rtPA или механическая тромбэктомия) лизиса сгустка. На сегодняшний день описаны различные модификации этой “модели нити накаливания”. В наиболее распространенном подходе, впервые описанном Longa et al. в 1989году 5нить с силиконовым покрытием вводится через общую сонную артерию (CCA) к происхождению MCA7. Хотя это широко используемый подход, эта модель не позволяет полностью восстановить кровоток во время реперфузии, так как ОАС постоянно перевязывается после удаления нити.
За последнее десятилетие все большее число исследовательских групп были заинтересованы в моделировании инсульта у мышей с использованием этой «модели нити». Однако значительная изменчивость этой модели и отсутствие стандартизации процедур являются одними из причин высокой изменчивости и плохой воспроизводимости экспериментальных результатов и научных выводов, о которых сообщалось до сих пор2,8. Потенциальной причиной нынешнего «кризиса репликации», относящегося к низкой воспроизводимости среди исследовательских лабораторий, являются несопоставимые объемы инфаркта инсульта между исследовательскими группами, использующими одну и ту же экспериментальную методологию9. Фактически, проведя первое доклиническое рандомизированное контролируемое многоцентровое исследование10,мы смогли подтвердить, что отсутствие достаточной стандартизации этой экспериментальной модели инсульта и последующих параметров исхода были основными причинами неспособности воспроизводимости в доклинических исследованиях между независимыми лабораториями11 . Эти резкие различия в результирующих размерах инфаркта, несмотря на использование одной и той же модели инсульта, справедливо представляют угрозу не только для подтверждающих исследований, но и для научного сотрудничества из-за отсутствия надежных и воспроизводимых моделей.
В свете этих проблем мы стремились разработать и подробно описать процедуру стандартизированной переходной модели MCAo, используемой для совместных исследований в рамках исследовательского консорциума «ImmunoStroke» (https://immunostroke.de/). Этот консорциум стремится понять мозг-иммунные взаимодействия, лежащие в основе механистических принципов восстановления после инсульта. Кроме того, представлены гистологические и связанные с ними функциональные методы анализа исходов инсульта. Все методы основаны на установленных стандартных операционных процедурах, используемых во всех исследовательских лабораториях консорциума ImmunoStroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает экспериментальную модель инсульта, основанную на консенсусном соглашении немецкого многоцентрового исследовательского консорциума («ImmunoStroke») о создании стандартизированной переходной модели MCAo. Переходная модель MCAo, созданная путем введения нити с сил…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех наших партнеров по сотрудничеству консорциумов ImmunoStroke (FOR 2879, От иммунных клеток до восстановления после инсульта) за предложения и обсуждения. Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии в рамках Мюнхенского кластера системной неврологии (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) и в рамках грантов LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 и LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
Riferimenti
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
