Modellering Slagtilfælde i mus: Forbigående Middle Cerebral Arterie Okklusion via den eksterne halspulsåre
Summary
Forskellige modeller af midten cerebral arterie okklusion (MCAo) anvendes i eksperimentel slagtilfælde forskning. Her beskrives en eksperimentel slagtilfældemodel af forbigående MCAo via den eksterne halspulsåre (ECA), som har til formål at efterligne human slagtilfælde, hvor cerebrovaskulær trombbus fjernes på grund af spontan blodprop lysis eller terapi.
Abstract
Slagtilfælde er den tredje mest almindelige årsag til dødelighed og den hyppigste årsag til erhvervet voksen handicap i de udviklede lande. Til dato, terapeutiske muligheder er begrænset til en lille andel af slagtilfælde patienter inden for de første timer efter slagtilfælde. Nye terapeutiske strategier er ved at blive grundigt undersøgt, især for at forlænge den terapeutiske tidsvindue. Disse nuværende undersøgelser omfatter studiet af vigtige patofysiologiske veje efter slagtilfælde, såsom post-slagtilfælde betændelse, angiogenese, neuronal plasticitet, og regenerering. I løbet af det sidste årti har der været stigende bekymring over den ringe reproducerbarhed af eksperimentelle resultater og videnskabelige resultater blandt uafhængige forskningsgrupper. For at overvinde den såkaldte “replikationskrise” er der et presserende behov for detaljerede standardiserede modeller for alle procedurer. Som en indsats inden for “ImmunoStroke” forskningskonsortium (https://immunostroke.de/), foreslås en standardiseret musemodel af forbigående mellem cerebral arterie okklusion (MCAo). Denne model gør det muligt fuldstændig restaurering af blodgennemstrømningen ved fjernelse af glødetråden, der simulerer den terapeutiske eller spontane blodprop lysis, der forekommer i en stor del af menneskelige slagtilfælde. Den kirurgiske procedure for denne “glødetråd” slagtilfælde model og værktøjer til sin funktionelle analyse er påvist i den ledsagende video.
Introduction
Slagtilfælde er en af de mest almindelige årsager til død og handicap på verdensplan. Selv om der hovedsageligt er to forskellige former for slagtilfælde, iskæmisk og hæmoragisk, 80-85% af alle slagtilfælde tilfælde er iskæmisk1. I øjeblikket er kun to behandlinger tilgængelige for patienter med iskæmisk slagtilfælde: farmakologisk behandling med rekombinant væv plasminogen aktivator (rtPA) eller mekanisk trombektomi. Men på grund af den smalle terapeutiske tidsvindue og flere udelukkelseskriterier kan kun et udvalgt antal patienter drage fordel af disse specifikke behandlingsmuligheder. I løbet af de sidste to årtier har præklinisk og translationel slagtilfældeforskning fokuseret på studiet af neuroprotektive tilgange. Men, alle forbindelser, der nåede kliniske forsøg har hidtil vist nogen forbedringer for patienten2.
Da in vitro-modeller ikke nøjagtigt kan reproducere alle hjerneinteraktioner og patofysiologiske mekanismer af slagtilfælde, er dyremodeller afgørende for præklinisk slagtilfældeforskning. Det er imidlertid ikke muligt at efterligne alle aspekter af human iskæmisk slagtilfælde i en enkelt dyremodel, da iskæmisk slagtilfælde er en meget kompleks og heterogen sygdom. Af denne grund er der udviklet forskellige iskæmiske slagtilfældemodeller over tid i forskellige arter. Fotothrombose af cerebral arterioles eller permanent distal okklusion af den midterste cerebral arterie (MCA) er almindeligt anvendte modeller, der fremkalder små og lokalt definerede læsioner i neocortex3,4. Udover dem, den mest almindeligt anvendte slagtilfælde model er sandsynligvis den såkaldte “glødetråd model”, hvor en forbigående okklusion af MCA er opnået. Denne model består af en forbigående introduktion af en sutur glødetråd til oprindelsen af MCA, hvilket fører til en brat reduktion af cerebral blodgennemstrømning og den efterfølgende store infarkt af subkortikale og kortikale hjerneområder5. Selvom de fleste slagtilfælde modeller efterligneR MCA okklusioner 6, “glødetråd model” giver mulighed for præcis afgrænsning af den iskæmiske tid. Reperfusion ved fjernelse af glødetråd efterligner det menneskelige kliniske scenario med cerebral blodgennemstrømning restaurering efter spontane eller terapeutiske (rtPA eller mekanisk trombektomi) blodprop lysis. Til dato er forskellige ændringer af denne “glødetrådsmodel” blevet beskrevet. I den mest almindelige tilgang, først beskrevet af Longa et al. i 19895indføres en siliciumbelagt glødetråd via den fælles halspulsåre (CCA) til oprindelsen af MCA7. Selv om det er en meget anvendt tilgang, denne model tillader ikke fuldstændig restaurering af blodgennemstrømningen under reperfusion, som CCA er permanent ligated efter fjernelse af glødetråd.
I løbet af det seneste årti har et stigende antal forskergrupper været interesseret i at modellere slagtilfælde hos mus ved hjælp af denne “glødetrådsmodel.” Imidlertid er den betydelige variation i denne model og den manglende standardisering af procedurerne nogle af årsagerne til den høje variation og dårlige reproducerbarhed af de eksperimentelle resultater og videnskabelige resultater, der hidtil er rapporteret2,8. En potentiel årsag til den nuværende “replikationskrise”, der henviser til den lave reproducerbarhed blandt forskningslaboratorier, er de ikke-sammenlignelige slaginfarktmængder mellem forskningsgrupper, der anvender den samme eksperimentelle metode9. Faktisk, efter at have gennemført den første prækliniske randomiserede kontrollerede multicenterforsøgsundersøgelse10, var vi i stand til at bekræfte, at manglen på tilstrækkelig standardisering af denne eksperimentelle slagtilfældemodel og de efterfølgende resultatparametre var hovedårsagerne til svigt af reproducerbarhed i prækliniske undersøgelser mellem uafhængige laboratorier11 . Disse drastiske forskelle i de resulterende infarktstørrelser udgør på trods af brug af den samme slagmodel med rette ikke kun en trussel mod bekræftende forskning, men også for videnskabelige samarbejder på grund af manglen på robuste og reproducerbare modeller.
I lyset af disse udfordringer havde vi til formål at udvikle og detaljeret beskrive proceduren for en standardiseret forbigående MCAo-model, som anvendes til forskningsindsatsen i forskningskonsortiet “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). Dette konsortium har til formål at forstå de hjerneimmune interaktioner, der ligger til grund for de mekanistiske principper for slagtilfældegendannelse. Derudover præsenteres histologiske og relaterede funktionelle metoder til analyse af slagtilfælde. Alle metoder er baseret på etablerede standarddriftsprocedurer, der anvendes i alle forskningslaboratorier i ImmunoStroke konsortiet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en eksperimentel slagtilfælde model baseret på konsensus aftale af en tysk multicenter forskningskonsortium (“ImmunoStroke”) at etablere en standardiseret forbigående MCAo model. Den forbigående MCAo-model, der er etableret ved at indføre en siliciumbelagt glødetråd gennem Revisionsretten til MCA’s oprindelse, er en af de mest anvendte slagtilfældemodeller for at opnå arteriel reperfusion efter en afgrænset okklusionsperiode. Derfor kan denne procedure betragtes som en translat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle vores samarbejdspartnere i ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til slagtilfælde opsving) for forslag og diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy inden for rammerne af München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) og under tilskuddene LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
Riferimenti
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
