Modellierung des Schlaganfalls bei Mäusen: Vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterien über die Arteria carotis externa
Summary
Verschiedene Modelle des mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) werden in der experimentellen Schlaganfallforschung eingesetzt. Hier wird ein experimentelles Schlaganfallmodell der transienten MCAo über die Arteria carotis externa (ECA) beschrieben, das darauf abzielt, den menschlichen Schlaganfall nachzuahmen, bei dem der zerebrovaskuläre Thrombus aufgrund einer spontanen Gerinnsellyse oder -therapie entfernt wird.
Abstract
Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für erworbene Behinderungen bei Erwachsenen in Industrieländern. Bisher beschränken sich die Therapiemöglichkeiten auf einen kleinen Teil der Schlaganfallpatienten innerhalb der ersten Stunden nach dem Schlaganfall. Neuartige Therapiestrategien werden intensiv untersucht, insbesondere um das therapeutische Zeitfenster zu verlängern. Diese aktuellen Untersuchungen umfassen die Untersuchung wichtiger pathophysiologischer Signalwege nach einem Schlaganfall, wie z.B. Entzündungen nach einem Schlaganfall, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration. In den letzten zehn Jahren hat die Besorgnis über die schlechte Reproduzierbarkeit von experimentellen Ergebnissen und wissenschaftlichen Erkenntnissen in unabhängigen Forschungsgruppen zugenommen. Um die sogenannte “Replikationskrise” zu überwinden, werden detaillierte standardisierte Modelle für alle Abläufe dringend benötigt. Im Rahmen des Forschungskonsortiums “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/) wird ein standardisiertes Mausmodell des transienten mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) vorgeschlagen. Dieses Modell ermöglicht die vollständige Wiederherstellung des Blutflusses nach Entfernung des Filaments und simuliert die therapeutische oder spontane Gerinnsellyse, die bei einem großen Teil der menschlichen Schlaganfälle auftritt. Der chirurgische Ablauf dieses “Filament”-Schlaganfallmodells und Werkzeuge zu seiner Funktionsanalyse werden im begleitenden Video demonstriert.
Introduction
Schlaganfall ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung weltweit. Obwohl es hauptsächlich zwei verschiedene Formen des Schlaganfalls gibt, ischämische und hämorrhagische, sind 80-85% aller Schlaganfallfälle ischämisch1. Derzeit stehen nur zwei Behandlungen für Patienten mit ischämischem Schlaganfall zur Verfügung: pharmakologische Behandlung mit rekombinantem Gewebeplasminogenaktivator (rtPA) oder mechanischer Thrombektomie. Aufgrund des engen therapeutischen Zeitfensters und mehrerer Ausschlusskriterien kann jedoch nur eine ausgewählte Anzahl von Patienten von diesen spezifischen Behandlungsmöglichkeiten profitieren. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die präklinische und translationale Schlaganfallforschung auf die Erforschung neuroprotektiver Ansätze konzentriert. Alle Verbindungen, die klinische Studien erreichten, haben jedoch bisher keine Verbesserungen für den Patienten gezeigt2.
Da In-vitro-Modelle nicht alle Gehirninteraktionen und pathophysiologischen Mechanismen des Schlaganfalls genau reproduzieren können, sind Tiermodelle für die präklinische Schlaganfallforschung von entscheidender Bedeutung. Es ist jedoch nicht möglich, alle Aspekte des ischämischen Schlaganfalls beim Menschen in einem einzigen Tiermodell nachzuahmen, da der ischämische Schlaganfall eine hochkomplexe und heterogene Erkrankung ist. Aus diesem Grund wurden im Laufe der Zeit verschiedene ischämische Schlaganfallmodelle bei verschiedenen Arten entwickelt. Photothrombose der Hirnarteriolen oder permanenter distaler Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA) sind häufig verwendete Modelle, die kleine und lokal definierte Läsionen im Neokortex induzieren3,4. Neben diesen ist das am häufigsten verwendete Schlaganfallmodell wahrscheinlich das sogenannte “Filamentmodell”, bei dem eine vorübergehende Okklusion von MCA erreicht wird. Dieses Modell besteht aus einer vorübergehenden Einführung eines Nahtfilaments in den Ursprung der MCA, was zu einer abrupten Verringerung des zerebralen Blutflusses und dem anschließenden großen Infarkt subkortikaler und kortikaler Hirnregionen führt5. Obwohl die meisten Schlaganfallmodelle MCA-Okklusionen nachahmen 6,erlaubt das “Filamentmodell” eine genaue Abgrenzung der ischämischen Zeit. Die Reperfusion durch Filamententfernung ahmt das menschliche klinische Szenario der wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach spontaner oder therapeutischer (rtPA oder mechanische Thrombektomie) Gerinnsellyse nach. Bisher wurden verschiedene Modifikationen dieses “Filamentmodells” beschrieben. In dem gebräuchlichsten Ansatz, der zuerst von Longa et al.beschrieben wurde. 19895wird ein siliziumbeschichtetes Filament über die gemeinsame Halsschlagader (CCA) zum Ursprung des MCA7eingeführt. Obwohl es sich um einen weit verbreiteten Ansatz handelt, erlaubt dieses Modell keine vollständige Wiederherstellung des Blutflusses während der Reperfusion, da das CCA nach der Entfernung des Filaments dauerhaft ligiert ist.
In den letzten zehn Jahren haben sich immer mehr Forschungsgruppen dafür interessiert, den Schlaganfall bei Mäusen mit diesem “Filamentmodell” zu modellieren. Die erhebliche Variabilität dieses Modells und die fehlende Standardisierung der Verfahren sind jedoch einige der Gründe für die hohe Variabilität und schlechte Reproduzierbarkeit der bisher berichteten experimentellen Ergebnisse und wissenschaftlichen Erkenntnisse2,8. Eine mögliche Ursache der aktuellen “Replikationskrise”, die sich auf die geringe Reproduzierbarkeit zwischen Forschungslabors bezieht, sind die nicht vergleichbaren Schlaganfall-Infarktvolumina zwischen Forschungsgruppen, die die gleiche experimentelle Methodik verwenden9. Tatsächlich konnten wir nach der Durchführung der ersten präklinischen randomisierten kontrollierten multizentrischen Studienstudie10bestätigen, dass das Fehlen einer ausreichenden Standardisierung dieses experimentellen Schlaganfallmodells und die nachfolgenden Ergebnisparameter die Hauptgründe für das Versagen der Reproduzierbarkeit in präklinischen Studien zwischen unabhängigen Laborswaren 11 . Diese drastischen Unterschiede in den resultierenden Infarktgrößen stellen trotz verwendung des gleichen Schlaganfallmodells zu Recht nicht nur eine Bedrohung für die bestätigende Forschung, sondern auch für wissenschaftliche Kooperationen dar, da es an robusten und reproduzierbaren Modellen mangelt.
Vor dem Hintergrund dieser Herausforderungen wollten wir das Verfahren für ein standardisiertes transientes MCAo-Modell, wie es für die gemeinsamen Forschungsanstrengungen innerhalb des Forschungskonsortiums “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/) verwendet wird, detailliert entwickeln und detailliert beschreiben. Dieses Konsortium zielt darauf ab, die Gehirn-Immun-Interaktionen zu verstehen, die den mechanistischen Prinzipien der Schlaganfall-Genesung zugrunde liegen. Darüber hinaus werden histologische und verwandte funktionelle Methoden zur Schlaganfall-Outcome-Analyse vorgestellt. Alle Methoden basieren auf etablierten Standardarbeitsanweisungen, die in allen Forschungslabors des ImmunoStroke-Konsortiums verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein experimentelles Schlaganfallmodell, das auf der Konsensvereinbarung eines deutschen multizentrischen Forschungskonsortiums (“ImmunoStroke”) zur Etablierung eines standardisierten transienten MCAo-Modells basiert. Das transiente MCAo-Modell, das durch die Einführung eines siliziumbeschichteten Filaments durch die ECA zum Ursprung des MCA etabliert wurde, ist eines der am häufigsten verwendeten Schlaganfallmodelle, um eine arterielle Reperfusion nach einer begrenzten Verschlussper…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen kooperationspartnern der ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) für Anregungen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) und im Rahmen der Grants LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 und LL-112/1-1 gefördert.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
Riferimenti
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