चूहों में मॉडलिंग स्ट्रोक: बाहरी कैरोटिड धमनी के माध्यम से क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी Occlusion
Summary
मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्यूज़न (एमसीएओ) के विभिन्न मॉडलों का उपयोग प्रायोगिक स्ट्रोक अनुसंधान में किया जाता है। यहां, बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) के माध्यम से क्षणिक एमसीएओ के एक प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन किया गया है, जिसका उद्देश्य मानव स्ट्रोक की नकल करना है, जिसमें सहज थक्का लाइसिस या थेरेपी के कारण सेरेब्रोवैस्कुलर थ्रोम्बस को हटा दिया जाता है।
Abstract
स्ट्रोक मृत्यु का तीसरा सबसे आम कारण है और विकसित देशों में अधिग्रहीत वयस्क विकलांगता का प्रमुख कारण है । आज तक, चिकित्सीय विकल्प स्ट्रोक के बाद पहले घंटे के भीतर स्ट्रोक रोगियों के एक छोटे से अनुपात तक ही सीमित हैं। उपन्यास चिकित्सकीय रणनीतियों की बड़े पैमाने पर जांच की जा रही है, विशेष रूप से चिकित्सीय समय खिड़की को लम्बा करने के लिए । इन वर्तमान जांचों में स्ट्रोक के बाद महत्वपूर्ण रोगविज्ञानी रास्तों का अध्ययन शामिल है, जैसे स्ट्रोक के बाद सूजन, एंजियोजेनेसिस, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी, और पुनर्जनन। पिछले दशक में, स्वतंत्र अनुसंधान समूहों के बीच प्रयोगात्मक परिणामों और वैज्ञानिक निष्कर्षों की खराब प्रजनन क्षमता के बारे में चिंता बढ़ रही है । तथाकथित “प्रतिकृति संकट” को दूर करने के लिए, सभी प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत मानकीकृत मॉडल की तत्काल आवश्यकता है। “इम्यूनोस्ट्रोक” अनुसंधान कंसोर्टियम (https://immunostroke.de/) के भीतर एक प्रयास के रूप में, क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्लुसेशन (एमसीएओ) का एक मानकीकृत माउस मॉडल प्रस्तावित है। यह मॉडल फिलामेंट को हटाने पर रक्त प्रवाह की पूरी बहाली की अनुमति देता है, जो मानव स्ट्रोक के एक बड़े हिस्से में होने वाले चिकित्सीय या सहज थक्के लाइसिस का अनुकरण करता है। इस “फिलामेंट” स्ट्रोक मॉडल और इसके कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपकरणों की शल्य प्रक्रिया साथ वीडियो में प्रदर्शित कर रहे हैं।
Introduction
स्ट्रोक दुनिया भर में मौत और विकलांगता के सबसे आम कारणों में से एक है । यद्यपि स्ट्रोक के मुख्य रूप से दो अलग-अलग रूप हैं, इस्कीमिक और रक्तस्राविक, सभी स्ट्रोक मामलों में से 80-85% इस्कीमिक1हैं। वर्तमान में, इस्कीमिक स्ट्रोक वाले रोगियों के लिए केवल दो उपचार उपलब्ध हैं: रीकॉम्बिनेंट ऊतक प्लाज्मिनोजेन एक्टिवेटर (आरटीपीए) या यांत्रिक थ्रोम्बेक्टॉमी के साथ औषधीय उपचार। हालांकि, संकीर्ण चिकित्सीय समय खिड़की और कई बहिष्कार मापदंड के कारण, रोगियों की केवल एक चुनिंदा संख्या इन विशिष्ट उपचार विकल्पों से लाभान्वित हो सकती है। पिछले दो दशकों में, प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल स्ट्रोक अनुसंधान ने न्यूरोप्रोटेक्टिव दृष्टिकोणों के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, नैदानिक परीक्षणों तक पहुंचने वाले सभी यौगिकों ने अब तक रोगी2के लिए कोई सुधार नहीं दिखाया है।
चूंकि इन विट्रो मॉडल स्ट्रोक के सभी मस्तिष्क इंटरैक्शन और रोगविज्ञानी तंत्र को सही ढंग से पुन: पेश नहीं कर सकते हैं, इसलिए पशु मॉडल प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, एक ही पशु मॉडल में मानव इस्कीमिक स्ट्रोक के सभी पहलुओं की नकल करना संभव नहीं है, क्योंकि इस्कीमिक स्ट्रोक एक अत्यधिक जटिल और विषम रोग है। इस कारण से विभिन्न प्रजातियों में समय के साथ अलग-अलग इस्कीमिक स्ट्रोक मॉडल विकसित किए गए हैं। सेरेब्रल आर्टेरियोल्स के फोटोथ्रोम्बोसिस या मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के स्थायी डिस्टल ऑक्क्लुस का आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडल होते हैं जो नियोकॉर्टेक्स3,4में छोटे और स्थानीय रूप से परिभाषित घावों को प्रेरित करते हैं। उन लोगों के अलावा, सबसे अधिक इस्तेमाल किया स्ट्रोक मॉडल शायद तथाकथित “फिलामेंट मॉडल,” जिसमें एमसीए के एक क्षणिक occlusion हासिल की है । इस मॉडल में एमसीए की उत्पत्ति के लिए एक सीवन फिलामेंट का क्षणिक परिचय होता है, जिससे मस्तिष्क रक्त प्रवाह में अचानक कमी आती है और बाद में घटाव और कॉर्टिकल मस्तिष्क क्षेत्रों का बड़ा इंफेक्शन5 होताहै। हालांकि अधिकांश स्ट्रोक मॉडल एमसीए ऑक्लसियन 6की नकल करते हैं, “फिलामेंट मॉडल” इस्कीमिक समय के सटीक परिसीमन की अनुमति देता है। फिलामेंट हटाने द्वारा रिफ्यूजन सहज या चिकित्सीय (आरटीपीए या यांत्रिक थ्रोम्बेक्टॉमी) क्लॉट लाइसिस के बाद मस्तिष्क रक्त प्रवाह बहाली के मानव नैदानिक परिदृश्य की नकल करता है। आज तक, इस “फिलामेंट मॉडल” के विभिन्न संशोधनों का वर्णन किया गया है। सबसे आम दृष्टिकोण में, पहले लोंगा एट अलद्वारा वर्णित है। 19895में, एक सिलिकॉन-लेपित फिलामेंट एमसीए 7 की उत्पत्ति के लिए आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) के माध्यम से पेश कियाजाताहै। हालांकि यह एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है, यह मॉडल रिफ्यूजन के दौरान रक्त प्रवाह की पूर्ण बहाली की अनुमति नहीं देता है, क्योंकि पीसीए को फिलामेंट को हटाने के बाद स्थायी रूप से लिगामेंट किया जाता है।
पिछले एक दशक में, अनुसंधान समूहों की बढ़ती संख्या इस “फिलामेंट मॉडल का उपयोग कर चूहों में स्ट्रोक मॉडलिंग में रुचि है.” तथापि, इस मॉडल की काफी परिवर्तनशीलता और प्रक्रियाओं के मानकीकरण की कमी प्रायोगिक परिणामों और वैज्ञानिक निष्कर्षों की उच्च परिवर्तनशीलता और खराब पुनरुत्पादनता के कुछ कारण हैंजोअब तक2,8रिपोर्ट किए गए हैं । वर्तमान “प्रतिकृति संकट” का एक संभावित कारण, अनुसंधान प्रयोगशालाओं के बीच कम प्रजनन क्षमता की चर्चा करते हुए, एक ही प्रयोगात्मक पद्धति9का उपयोग कर अनुसंधान समूहों के बीच गैर तुलनीय स्ट्रोक infarct संस्करणों है । वास्तव में, पहले प्रीक्लिनिकल यादृच्छिक नियंत्रित मल्टीसेंटर परीक्षण अध्ययन10आयोजित करने के बाद, हम इस बात की पुष्टि करने में सक्षम थे कि इस प्रायोगिक स्ट्रोक मॉडल के पर्याप्त मानकीकरण की कमी और बाद के परिणाम पैरामीटर स्वतंत्र प्रयोगशालाओं के बीच प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रजनन क्षमता की विफलता के मुख्य कारण थे11 . परिणामस्वरूप infarct आकार में इन कठोर मतभेदों, एक ही स्ट्रोक मॉडल का उपयोग करने के बावजूद, उचित न केवल पुष्टित्मक अनुसंधान के लिए एक खतरा पैदा करते हैं, लेकिन यह भी मजबूत और प्रजनन मॉडल की कमी के कारण वैज्ञानिक सहयोग के लिए ।
इन चुनौतियों के प्रकाश में, हम विकसित करने और विस्तार से एक मानकीकृत क्षणिक MCAo मॉडल के लिए प्रक्रिया का वर्णन करने के रूप में “इम्यूनोस्ट्रोक” अनुसंधान कंसोर्टियम (https://immunostroke.de/) के भीतर सहयोगात्मक अनुसंधान के प्रयासों के लिए इस्तेमाल किया उद्देश्य । इस कंसोर्टियम का उद्देश्य स्ट्रोक वसूली के मशीनी सिद्धांतों में अंतर्निहित मस्तिष्क-प्रतिरक्षा बातचीत को समझना है। इसके अलावा, स्ट्रोक परिणाम विश्लेषण के लिए हिस्टोलॉजिकल और संबंधित कार्यात्मक तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। सभी विधियां इम्यूनोस्ट्रोक कंसोर्टियम की सभी शोध प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली स्थापित मानक परिचालन प्रक्रियाओं पर आधारित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल एक मानकीकृत क्षणिक एमसीएओ मॉडल स्थापित करने के लिए एक जर्मन मल्टीसेंटर रिसर्च कंसोर्टियम (“इम्यूनोस्ट्रोक”) के आम सहमति समझौते के आधार पर एक प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन करता ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सुझावों और चर्चाओं के लिए इम्यूनोस्ट्रोक संघ (2879 के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्ट्रोक रिकवरी तक) के हमारे सभी सहयोग भागीदारों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) सिस्टम न्यूरोलॉजी के लिए म्यूनिख क्लस्टर के ढांचे के भीतर जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत (EXC २१४५ SyNergy-आईडी 390857198) और अनुदान के तहत ली-2534/6-1, LI-2534/7-1 और LL-112/1-1 ।
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
Riferimenti
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
