Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa
Summary
Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.
Abstract
El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de mortalidad y la principal causa de discapacidad adquirida en adultos en los países desarrollados. Hasta la fecha, las opciones terapéuticas se limitan a una pequeña proporción de pacientes con accidente cerebrovascular dentro de las primeras horas después del accidente cerebrovascular. Se están investigando ampliamente nuevas estrategias terapéuticas, especialmente para prolongar la ventana de tiempo terapéutico. Estas investigaciones actuales incluyen el estudio de importantes vías fisiopatológicas después del accidente cerebrovascular, como la inflamación posterior al accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Durante la última década, ha habido una creciente preocupación por la escasa reproducibilidad de los resultados experimentales y los hallazgos científicos entre los grupos de investigación independientes. Para superar la llamada “crisis de replicación”, se necesitan urgentemente modelos estandarizados detallados para todos los procedimientos. Como un esfuerzo dentro del consorcio de investigación “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/), se propone un modelo de ratón estandarizado de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAo). Este modelo permite la restauración completa del flujo sanguíneo tras la eliminación del filamento, simulando la lisis de coágulos terapéutica o espontánea que se produce en una gran proporción de accidentes cerebrovasculares humanos. El procedimiento quirúrgico de este modelo de accidente cerebrovascular de “filamento” y las herramientas para su análisis funcional se muestran en el video adjunto.
Introduction
El accidente cerebrovascular es una de las causas más comunes de muerte y discapacidad en todo el mundo. Aunque hay principalmente dos formas distintas de accidente cerebrovascular, isquémico y hemorrágico, el 80-85% de todos los casos de accidente cerebrovascular son isquémicos1. Actualmente, solo hay dos tratamientos disponibles para pacientes con accidente cerebrovascular isquémico: tratamiento farmacológico con activador tisular recombinante del plasminógeno (rtPA) o trombectomía mecánica. Sin embargo, debido a la estrecha ventana de tiempo terapéutico y los múltiples criterios de exclusión, solo un número selecto de pacientes puede beneficiarse de estas opciones de tratamiento específicas. Durante las últimas dos décadas, la investigación preclínica y traslacional del accidente cerebrovascular se ha centrado en el estudio de los enfoques neuroprotectores. Sin embargo, todos los compuestos que llegaron a los ensayos clínicos hasta ahora no han mostrado mejoras para el paciente2.
Dado que los modelos in vitro no pueden reproducir con precisión todas las interacciones cerebrales y los mecanismos fisiopatológicos del accidente cerebrovascular, los modelos animales son cruciales para la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. Sin embargo, imitar todos los aspectos del accidente cerebrovascular isquémico humano en un solo modelo animal no es factible, ya que el accidente cerebrovascular isquémico es una enfermedad altamente compleja y heterogénea. Por esta razón, se han desarrollado diferentes modelos de accidente cerebrovascular isquémico a lo largo del tiempo en diferentes especies. La fototrombosis de las arteriolas cerebrales o la oclusión distal permanente de la arteria cerebral media (ACM) son modelos de uso común que inducen lesiones pequeñas y localmente definidas en el neocórtex3,4. Además de esos, el modelo de accidente cerebrovascular más utilizado es probablemente el llamado “modelo de filamento”, en el que se logra una oclusión transitoria de MCA. Este modelo consiste en una introducción transitoria de un filamento de sutura al origen del ACM, dando lugar a una reducción brusca del flujo sanguíneo cerebral y al posterior gran infarto de regiones cerebrales subcorticales y corticales5. Aunque la mayoría de los modelos de trazo imitan las oclusiones MCA 6,el “modelo de filamento” permite la delimitación precisa del tiempo isquémico. La reperfusión por eliminación de filamentos imita el escenario clínico humano de la restauración del flujo sanguíneo cerebral después de la lisis espontánea o terapéutica (rtPA o trombectomía mecánica). Hasta la fecha, se han descrito diferentes modificaciones de este “modelo de filamento”. En el enfoque más común, descrito por primera vez por Longa et al. en 19895, se introduce un filamento recubierto de silicio a través de la arteria carótida común (CCA) al origen del MCA7. Aunque es un enfoque ampliamente utilizado, este modelo no permite la restauración completa del flujo sanguíneo durante la reperfusión, ya que el CCA se liga permanentemente después de la eliminación del filamento.
Durante la última década, un número creciente de grupos de investigación se han interesado en modelar el accidente cerebrovascular en ratones utilizando este “modelo de filamento”. Sin embargo, la considerable variabilidad de este modelo y la falta de estandarización de los procedimientos son algunas de las razones de la alta variabilidad y escasa reproducibilidad de los resultados experimentales y hallazgos científicos reportados hasta el momento2,8. Una causa potencial de la actual “crisis de replicación”, refiriéndose a la baja reproducibilidad entre los laboratorios de investigación, son los volúmenes de infarto de ictus no comparables entre grupos de investigación que utilizan la misma metodología experimental9. De hecho, después de realizar el primer estudio preclínico aleatorizado controlado multicéntrico10,pudimos confirmar que la falta de estandarización suficiente de este modelo experimental de accidente cerebrovascular y los parámetros de resultado posteriores fueron las principales razones del fracaso de la reproducibilidad en estudios preclínicos entre laboratorios independientes11 . Estas diferencias drásticas en los tamaños de infarto resultantes, a pesar de usar el mismo modelo de accidente cerebrovascular, representan justificadamente no solo una amenaza para la investigación confirmatoria, sino también para las colaboraciones científicas debido a la falta de modelos robustos y reproducibles.
A la luz de estos desafíos, nuestro objetivo fue desarrollar y describir en detalle el procedimiento para un modelo MCAo transitorio estandarizado utilizado para los esfuerzos de investigación colaborativa dentro del consorcio de investigación “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). Este consorcio tiene como objetivo comprender las interacciones cerebro-inmunidad subyacentes a los principios mecanicistas de la recuperación del accidente cerebrovascular. Además, se presentan métodos histológicos y funcionales relacionados para el análisis de resultados de accidente cerebrovascular. Todos los métodos se basan en procedimientos operativos estándar establecidos utilizados en todos los laboratorios de investigación del consorcio ImmunoStroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular basado en el acuerdo de consenso de un consorcio de investigación multicéntrico alemán (“ImmunoStroke”) para establecer un modelo MCAo transitorio estandarizado. El modelo MCAo transitorio establecido mediante la introducción de un filamento recubierto de silicio a través del ECA hasta el origen del MCA es uno de los modelos de ictus más utilizados para lograr la reperfusión arterial tras un periodo de oclusión delimitado. Por lo t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos nuestros socios colaboradores de los Consorcios ImmunoStroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) por sus sugerencias y discusiones. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania en el marco del Clúster de Munich para la Neurología de Sistemas (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) y bajo las subvenciones LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 y LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
Riferimenti
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
