Modellering stroke hos möss: Transient Middle Cerebral Artery Ocklusion via den yttre halsartären
Summary
Olika modeller av mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAo) används i experimentell stroke forskning. Här beskrivs en experimentell stroke modell av transienta MCAo via den externa halsartären (ECA) som syftar till att efterlikna mänskliga stroke, där cerebrovaskulära tromb tas bort på grund av spontan blodpropp lys eller terapi.
Abstract
Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och den främsta orsaken till förvärvad vuxen invaliditet i utvecklade länder. Hittills är terapeutiska alternativ begränsade till en liten andel strokepatienter inom de första timmarna efter stroke. Nya terapeutiska strategier undersöks i stor utsträckning, särskilt för att förlänga det terapeutiska tidsfönstret. Dessa aktuella undersökningar inkluderar studier av viktiga patofysiologiska vägar efter stroke, såsom post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticitet och regenerering. Under det senaste decenniet har oron ökat för den dåliga reproducerbarheten hos experimentella resultat och vetenskapliga rön bland oberoende forskargrupper. För att övervinna den så kallade “replikeringskrisen” behövs det ett trängande behov av detaljerade standardiserade modeller för alla förfaranden. Som ett försök inom forskningskonsortiet “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/) föreslås en standardiserad musmodell av transienta mellersta cerebrala arteriell ocklusion (MCAo). Denna modell möjliggör fullständig restaurering av blodflödet vid avlägsnande av filamentet, simulerar den terapeutiska eller spontana blodpropplysen som förekommer i en stor andel mänskliga stroke. Det kirurgiska ingreppet i denna “filament” stroke modell och verktyg för dess funktionella analys visas i den medföljande videon.
Introduction
Stroke är en av de vanligaste orsakerna till dödsfall och funktionshinder i världen. Även om det huvudsakligen finns två distinkta former av stroke, ischemisk och hemorragisk, är 80-85% av alla strokefall ischemiska1. För närvarande finns endast två behandlingar tillgängliga för patienter med ischemisk stroke: farmakologisk behandling med rekombinant vävnad plasminogen aktivator (rtPA) eller mekanisk trombectomy. På grund av det snäva terapeutiska tidsfönstret och flera uteslutningskriterier kan dock endast ett utvalt antal patienter dra nytta av dessa specifika behandlingsalternativ. Under de senaste två decennierna har preklinisk och translationell strokeforskning fokuserat på studier av neuroprotektiva metoder. Emellertid, alla föreningar som nått kliniska prövningar har hittills visat inga förbättringar för patienten2.
Eftersom in vitro-modeller inte exakt kan reproducera alla hjärninteraktioner och patofysiologiska mekanismer för stroke, är djurmodeller avgörande för preklinisk strokeforskning. Att efterlikna alla aspekter av mänsklig ischemisk stroke i en enda djurmodell är dock inte genomförbart, eftersom ischemisk stroke är en mycket komplex och heterogen sjukdom. Av denna anledning har olika ischemiska strokemodeller utvecklats över tid hos olika arter. Fototrobosis av cerebrala arterioles eller permanent distala ocklusion av den mellersta cerebrala artären (MCA) är vanliga modeller som inducerar små och lokalt definierade skador i neocortex3,4. Förutom dessa är den vanligaste slagmodellen förmodligen den så kallade “filamentmodellen”, där en övergående ocklusion av MCA uppnås. Denna modell består av en övergående introduktion av en suturglödtråd till MCA: s ursprung, vilket leder till en plötslig minskning av det cerebrala blodflödet och den efterföljande stora hjärtinfarkten av subkortikala och när hjärnregioner5. Även om de flesta strokemodeller efterliknar MCA-ocklusioner 6, tillåter “filamentmodellen” exakt avgränsning av den skandinaviska tiden. Reperfusion genom filament borttagning efterliknar det mänskliga kliniska scenariot av cerebrala blodflöde restaurering efter spontana eller terapeutiska (rtPA eller mekaniska thrombectomy) blodpropp lys. Hittills har olika modifieringar av denna “filamentmodell” beskrivits. I det vanligaste tillvägagångssättet, först beskrivet av Longa et al. År 19895införs en kiselbelagd filament via den gemensamma halspulsådern (CCA) till ursprunget till MCA7. Även om det är ett allmänt använt tillvägagångssätt, tillåter denna modell inte fullständig restaurering av blodflödet under reperfusion, eftersom CCA är permanent ligerad efter avlägsnande av filamentet.
Under det senaste decenniet har ett ökande antal forskargrupper varit intresserade av att modellera stroke hos möss med hjälp av denna “filamentmodell”. Den avsevärda variationen i denna modell och bristen på standardisering av förfarandena är dock några av orsakerna till den höga variabiliteten och den dåliga reproducerbarheten hos de experimentella resultat och vetenskapliga rön som rapporterats hittills2,8. En potentiell orsak till den nuvarande “replikeringskrisen”, med hänvisning till den låga reproducerbarheten bland forskningslaboratorier, är de icke-jämförbara slagfarktvolymerna mellan forskargrupper med samma experimentella metod9. Faktum är att efter att ha genomfört den första prekliniska randomiserade kontrollerade multicenterstudiestudien10, kunde vi bekräfta att bristen på tillräcklig standardisering av denna experimentella strokemodell och de efterföljande utfallsparametrarna var de främsta orsakerna till reproducerbarhetsfelet i prekliniska studier mellan oberoende laboratorier11 . Dessa drastiska skillnader i de resulterande infarktstorlekarna, trots att man använder samma strokemodell, utgör med rätta inte bara ett hot mot bekräftande forskning, utan också för vetenskapliga samarbeten på grund av bristen på robusta och reproducerbara modeller.
Mot bakgrund av dessa utmaningar ville vi utveckla och beskriva i detalj förfarandet för en standardiserad transient MCAo-modell som används för forskningsinsatserna inom forskningskonsortiet “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). Detta konsortium syftar till att förstå de hjärn-immun interaktioner som ligger till grund för de mekanistiska principerna för stroke återhämtning. Dessutom presenteras histologiska och relaterade funktionella metoder för stroke resultat analys. Alla metoder bygger på etablerade standardrutiner som används i alla forskningslaboratorier i ImmunoStroke-konsortiet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en experimentell stroke modell baserat på konsensus överenskommelsen av ett tyskt multicenter forskningskonsortium (“ImmunoStroke”) att upprätta en standardiserad transient MCAo modell. Den övergående MCAo-modellen som upprättats genom att införa en kiselbelagd filament genom revisionsrätten till ursprunget till MCA är en av de mest använda slagmodellerna för att uppnå arteriell reperfusion efter en avgränsad ocklusionsperiod. Därför kan denna procedur betraktas som en översättn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla våra samarbetspartners till ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) för förslag och diskussioner. Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands excellencestrategi inom ramen för Münchenklustret för systemneuri (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) och under bidragen LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 och LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
Riferimenti
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
