차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인
Summary
여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.
Abstract
DNA의 이중 가닥 파단 (DSBs)은 DNA 손상의 가장 세포 독성 유형입니다. 무수한 모욕이 이러한 병변 (예 : 복제 스트레스, 이온화 방사선, 복구되지 않은 UV 손상)을 초래할 수 있기 때문에 DSB는 매일 대부분의 세포에서 발생합니다. 세포 사멸 이외에도, 복구되지 않은 DSB는 게놈 완전성을 감소시키고 생성된 돌연변이는 종양 발생을 유도할 수 있다. 이러한 위험과 DSB의 유병률은 세포가 이러한 병변을 복구하는 메커니즘에 대한 조사에 동기를 부여합니다. 차세대 시퀀싱은 이온화 방사선에 의한 DSB의 유도와 쌍을 이루어 DSB 수리 결함과 관련된 돌연변이를 정확하게 정의하는 강력한 도구를 제공합니다. 그러나 이러한 접근법은 이온화 방사선과 관련된 무작위로 발생하는 DSB의 복구를 검출하기 위해 계산적으로 어렵고 비용이 많이 드는 전체 게놈 시퀀싱이 필요합니다. I-Sce1과 같은 희귀 절단 엔도뉴클레아제는 단일 DSB를 생성하는 능력을 제공하지만, 이들의 인식 부위는 관심 게놈에 삽입되어야 한다. 결과적으로 수리 현장은 본질적으로 인위적입니다. 최근의 진보는 가이드 RNA (sgRNA)가 Cas9 엔도뉴클레아제를 관심있는 임의의 게놈 유전자좌로 향하게 할 수있게합니다. 이는 DSB 복구 연구에 적용될 수 있으며, Cas9 유도 DSB를 플랭킹하는 DNA에 초점을 맞출 수 있도록 함으로써 차세대 시퀀싱을 보다 비용 효율적으로 만들 수 있습니다. 원고의 목표는 CD4 유전자의 DSB 상류의 복구로부터 유래하는 돌연변이를 정의할 수 있는 프로토콜을 제시함으로써 이러한 접근법의 실현 가능성을 입증하는 것이다. 이 프로토콜은 비교적 제한된 계산 요구 사항을 가진 복구 억제제, 바이러스 단백질 발현, 돌연변이 및 환경 노출과 같은 외인성 인자와 관련된 DSB의 돌연변이 유발 잠재력의 변화를 결정하도록 적응될 수 있다. 일단 유기체의 게놈이 시퀀싱되면, 이 방법은 이론적으로 임의의 게놈 유전자좌 및 형질감염될 수 있는 그 유기체의 임의의 세포 배양 모델에서 사용될 수 있다. 접근법의 유사한 적응은 동일한 유전 적 배경에서 다른 유전자좌 사이의 복구 충실도의 비교를 허용 할 수 있습니다.
Introduction
게놈 안정성을 유지하는 것은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요합니다. 정확한 DNA 복제와 강력한 DNA 손상 반응(DDR)은 유전 물질 1,2를 충실하게 전파하는 데 필요합니다. DNA 손상은 대부분의 세포 2,3에서 정기적으로 발생합니다. 이러한 손상이 감지되면 세포 주기 진행이 중단되고 DNA 복구 메커니즘이 활성화됩니다. DNA 또는 DSB의 이중 가닥 파단은 가장 독성이 강하고 돌연변이 유발 유형의 DNA 손상 3,4입니다.
몇몇 DDR 신호전달 경로가 이러한 병변을 복구할 수 있지만, 가장 철저하게 연구된 DSB 복구 경로는 상동성 재조합(HR) 및 비상동성 말단 접합(NHEJ)이다. HR은 자매 크로마티드를 상동성 주형으로 사용하여 DSB를 수리하는 크게 오류가 없는 경로입니다. 이것은 세포 주기 5,6,7의 S 단계 및 G2 단계에서 일어나는 경향이 있다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉽지만 세포 주기 8,9에 걸쳐 발생할 수 있습니다. 특정 수리 메커니즘(10,11,12)의 효율을 측정하기 위해 다양한 리포터 분석법이 개발되었다. 이들 검정은 판독값11,13으로서 GFP 또는 mCherry를 사용하는 DSB 복구 경로 활성의 높은 처리량 측정을 위해 유세포 분석기에 의존하는 경향이 있다. 매우 효율적이지만 인위적으로 도입 된 DSB에서 발생하는 정식 수리에 의존합니다.
DSB 수리를 연구하는 데 사용되는 다양한 다른 방법이 있습니다. 이들 중 다수는 면역형광(IF) 현미경1,14에 의존한다. IF 현미경 검사는 DSB가 유전 독성 화학 물질 또는 이온화 방사선15,16에 노출되어 유도 된 후 수리 복합체를 대표하는 이산 핵 초점을 감지합니다. 이러한 초점의 형성 및 해결을 추적하는 것은 각각14,17 개의 수리 개시 및 완료의 표시를 제공한다. 그러나, DSB 유도의 이들 방법(즉, 화학물질 또는 이온화 방사선)은 게놈 내의 정의된 위치에서 DSB를 야기하지 않는다. 또한 DSB의 적은 수(예를 들어, 2-4개)만을 일관되게 유도하기 위해 이들을 사용하는 것도 기능적으로 불가능하다. 결과적으로, DSBs를 유도하는 가장 일반적으로 사용되는 방법은 게놈18 전체에 걸쳐 무작위로 분포된 다수의 병변을 야기한다. 소수의 DSB는 희귀 절단된 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 삽입하고 I-Sce119와 같은 관련 엔도뉴클레아제를 발현함으로써 도입될 수 있다. 불행하게도, 표적 부위의 요구되는 통합은 내인성 게놈 유전자좌에서 DSB의 검사를 방지한다.
이 원고는 사용자 정의 유전자좌에서 생성 된 DSB의 복구와 관련된 돌연변이를 탐지하는 방법을 설명합니다. 우리는 DSB와 관련된 돌연변이의 수를 증가시키는 바이러스 단백질의 능력을 평가하기 위해 적용된 접근법의 대표적인 예를 제공한다. 구체적으로, 본 원고는 인간 유두종 바이러스 유형 8(HFK 8E6)의 E6 단백질을 발현하는 벡터 조절(HFK LXSN) 및 HFK에서 인간 CD4 오픈 리딩 프레임에서 DSB를 유도하기 위해 CAS9 엔도뉴클레아제를 지시하기 위한 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 사용을 기술한다. 파단을 둘러싸는 영역의 표적화된 차세대 염기서열 분석(NGS)은 병변의 복구와 관련된 돌연변이가 엄격하게 정의될 수 있게 한다. 이들 데이터는 바이러스 단백질이 DSB 복구 동안 돌연변이의 약 20배 증가를 야기한다는 것을 입증한다. 또한 전체 게놈 시퀀싱이 필요 없이 단일 유전자좌에서 DSB의 돌연변이 유발 결과의 편향되지 않은 특성화를 제공한다. 원칙적으로, 프로토콜은 게놈 유전자좌 또는 세포주 사이의 돌연변이의 상대적 위험을 비교하기 위해 용이하게 적응될 수 있었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제공된 정보의 깊이 외에도이 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, DSB 복구는, 이론적으로, 관심있는 세포의 게놈을 변형시키지 않고 임의의 게놈 유전자좌에서 평가될 수 있다. 둘째, 수리에 대한 NGS 분석에 대한 액세스는 정의된 영역을 대상으로 하는 단일 DSB를 만들고 분석함으로써 제공되는 비용 절감 및 계산 노력으로 증가합니다. 마지막으로, 추가적인 유기체의 게놈이 일상적으로 이?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고에보고 된 연구는 국립 보건원 (P20GM130448)의 국립 일반 의료 과학 연구소 (NAW 및 RP)의 지원을 받았다. 국립 보건원 국립 암 연구소 (NCI R15 CA242057 01A1); 캔자스 주립 대학의 존슨 암 연구 센터; 및 미국 국방부 (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). 우리는 우리의 면역 형광 현미경 검사에 대한 KSU-CVM 공초점 코어와 조엘 산네만에게 감사드립니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 이러한 자금 조달 기관의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
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