Метод микроинъекции эмбрионов Anopheles gambiae
Summary
Методы микроинъекции необходимы для введения экзогенных генов в геномы комаров. Этот протокол объясняет метод, используемый лабораторией Джеймса для микроинъекции ДНК в эмбрионы Anopheles gambiae для генерации трансформированных комаров.
Abstract
Методы микроинъекции эмбрионов необходимы для многих молекулярных и генетических исследований видов насекомых. Они обеспечивают средства для введения экзогенных фрагментов ДНК, кодирующих интересующие гены, а также благоприятные признаки в зародышевую линию насекомых стабильным и наследуемым образом. Полученные трансгенные штаммы могут быть изучены на предмет фенотипических изменений, возникающих в результате экспрессии интегрированной ДНК для ответа на основные вопросы или использованы в практических приложениях. Хотя технология проста, она требует от исследователя терпения и практики для достижения уровня мастерства, который максимизирует эффективность. Здесь показан метод микроинъекции эмбрионов африканского малярийного комара Anopheles gambiae. Цель состоит в том, чтобы доставить путем микроинъекции экзогенную ДНК к эмбриону, чтобы она могла быть поглощена развивающимися клетками зародышевой линии (полюса). Экспрессия из введенной ДНК транспозаз, интеграз, рекомбиназ или других нуклеаз (например, CRISPR-ассоциированных белков, Cas) может вызвать события, которые приводят к его ковалентной вставке в хромосомы. Трансгенные An. gambiae, полученные на основе этих технологий, были использованы для фундаментальных исследований компонентов иммунной системы, генов, участвующих в кроветворении, и элементов обонятельной системы. Кроме того, эти методы были использованы для получения штаммов An. gambiae с признаками, которые могут помочь контролировать передачу малярийных паразитов.
Introduction
Методы микроинъекции использовались для экспериментального манипулирования организмами с начала 1900-х годов1. Микроинъекция использовалась для изучения как основных биологических функций, так и/или внесения важных изменений в биологию желаемого организма. Метод микроинъекции представляет особый интерес для векторных биологов и широко используется для манипулирования векторными геномами2-11. Эксперименты по трансгенезу на векторах членистоногих часто направлены на то, чтобы сделать векторы менее эффективными при передаче патогенов путем либо внесения изменений, которые уменьшают приспособленность вектора, либо повышения рефрактерности к патогенам, которые они передают. Комары передают различные патогены человека и оказывают значительное влияние на заболеваемость и смертность во всем мире. Род комаров Anopheles передает паразитарным возбудителям малярии человека, Plasmodium spp. Генно-инженерные эксперименты с Anopheles были направлены на лучшее понимание биологии и снижение векторной способности этих комаров в усилиях по разработке новых стратегий элиминации малярии.
Комары-переносчики, которые способствуют наибольшему количеству случаев заражения малярией во всем мире, находятся в видовом комплексе Anopheles gambiae. Тем не менее, большинство успешных экспериментов по трансгенезу были проведены на переносчике малярии индийского субконтинента Anopheles stephensi. В то время как существует множество лабораторно адаптированных штаммов Anopheles gambiae, количество трансгенных линий Anopheles gambiae spp., о которых сообщается в литературе, не сравнится с количеством линий Anopheles stephensi. Считается, что эмбрион Anopheles gambiae труднее ввести и достичь успешного трансгенеза, чем Anopheles stephensi,хотя причины этих различий неизвестны. Этот протокол описывает метод, который доказал свою неизменно успешную способность к достижению трансгенеза эмбрионов Anopheles gambiae с помощью микроинъекции. Протокол основан на методе, ранее разработанном Эрве Боссеном и Марком Бенедиктом12 с добавлением некоторых дополнительных деталей и изменений, которые, как было установлено, повышают эффективность трансгенеза.
Protocol
Representative Results
Discussion
С увеличением доступности точных и гибких технологий генной инженерии, таких как CRISPR / Cas9, трансгенные организмы могут быть разработаны более простым и стабильным способом, чем это было возможно ранее. Эти инструменты позволили исследователям создать трансгенные штаммы комаров-перено…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Друзилле Стиллингер, Кионе Паркер, Пэрриш Пауэлл и Мадлен Ноттоли за разведение комаров. Финансирование было предоставлено Калифорнийским университетом, Ирвинской инициативой по борьбе с малярией. AAJ является профессором Дональда Брена в Калифорнийском университете в Ирвине.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Riferimenti
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
