Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens
Summary
Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.
Abstract
Les techniques de micro-injection embryonnaire sont essentielles pour de nombreuses études moléculaires et génétiques d’espèces d’insectes. Ils fournissent un moyen d’introduire des fragments d’ADN exogènes codant pour des gènes d’intérêt ainsi que des traits favorables dans la lignée germinale de l’insecte de manière stable et héréditaire. Les souches transgéniques résultantes peuvent être étudiées pour les changements phénotypiques résultant de l’expression de l’ADN intégré pour répondre à des questions de base ou utilisées dans des applications pratiques. Bien que la technologie soit simple, elle exige de l’enquêteur de la patience et de la pratique pour atteindre un niveau de compétence qui maximise l’efficacité. On voit ici une méthode de micro-injection d’embryons du moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae. L’objectif est de délivrer par microinjection de l’ADN exogène à l’embryon afin qu’il puisse être absorbé dans les cellules germinales (pôles) en développement. L’expression à partir de l’ADN injecté de transposases, d’intégrases, de recombinases ou d’autres nucléases (par exemple les protéines associées à CRISPR, Cas) peut déclencher des événements qui conduisent à son insertion covalente dans les chromosomes. L’An. gambiae transgénique généré à partir de ces technologies a été utilisé pour des études de base des composants du système immunitaire, des gènes impliqués dans l’alimentation sanguine et des éléments du système olfactif. En outre, ces techniques ont été utilisées pour produire des souches d’An. gambiae avec des caractéristiques qui peuvent aider à contrôler la transmission des parasites du paludisme.
Introduction
Les techniques de micro-injection sont utilisées pour manipuler expérimentalement des organismes depuis le début des années 19001. La microinjection a été utilisée pour étudier à la fois les fonctions biologiques de base et / ou introduire des changements importants dans la biologie d’un organisme désiré. La technique de micro-injection a été d’un intérêt particulier pour les biologistes vecteurs et a été largement utilisée pour manipuler les génomes vectoriels2-11. Les expériences de transgénèse chez les vecteurs arthropodes visent souvent à rendre les vecteurs moins efficaces pour transmettre les agents pathogènes en adoptant des changements qui diminuent la capacité physique d’un vecteur ou augmentent la réfractaireté des agents pathogènes qu’ils transmettent. Les moustiques transmettent une variété d’agents pathogènes humains et ont un impact significatif sur la morbidité et la mortalité dans le monde entier. Le genre de moustiques Anopheles transmet les agents pathogènes parasites du paludisme humain, Plasmodium spp. Les expériences de génie génétique avec les anophèles ont visé à mieux comprendre la biologie et à réduire la capacité vectorielle de ces moustiques dans le but de développer de nouvelles stratégies d’élimination du paludisme.
Les moustiques vecteurs qui contribuent le plus au nombre d’infections palustres dans le monde se trouvent dans le complexe d’espèces Anopheles gambiae. Cependant, la majorité des expériences de transgénèse réussies ont été réalisées sur le vecteur du paludisme du sous-continent indien, Anopheles stephensi. Bien qu’il existe de nombreuses souches d’Anopheles gambiae adaptées en laboratoire, le nombre de lignées transgéniques d’Anopheles gambiae spp. rapportées dans la littérature ne se compare pas à celui d’Anopheles stephensi. On pense que l’embryon d’Anophèle gambie est plus difficile à injecter et à réussir la transgénèse que Anopheles stephensi,bien que les raisons de ces différences soient inconnues. Ce protocole décrit une méthode qui s’est avérée toujours efficace pour réaliser la transgénèse des embryons d’Anophèles gambiae par micro-injection. Le protocole est basé sur une méthode précédemment développée par Hervé Bossin et Mark Benedict12 avec quelques détails et modifications supplémentaires qui ont été trouvés pour augmenter l’efficacité de la transgénèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grâce à la disponibilité accrue de technologies de génie génétique précises et flexibles telles que CRISPR/Cas9, les organismes transgéniques peuvent être développés de manière plus simple et plus stable qu’auparavant. Ces outils ont permis aux chercheurs de créer des souches transgéniques de moustiques vecteurs qui sont très proches d’atteindre les propriétés souhaitées de réfractaire aux agents pathogènes (modification de la population) ou de stérilité héréditaire (suppression de la populati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell et Madeline Nottoli pour l’élevage des moustiques. Le financement a été fourni par l’Université de Californie, Irvine Malaria Initiative. AAJ est professeur Donald Bren à l’Université de Californie à Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Riferimenti
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