アノフェレスガンビア胚の微小注入法
Summary
蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。
Abstract
胚マイクロインジェクション技術は、昆虫種の多くの分子遺伝学的研究に不可欠です。彼らは、目的の遺伝子をコードする外因性DNA断片と、安定かつ遺伝性の方法で昆虫生殖細胞系列に有利な形質を導入する手段を提供する。得られたトランスジェニック株は、基本的な質問に答えたり、実用化に使用したりするために、統合DNAの発現に起因する表現型変化について研究することができる。この技術は簡単ですが、効率を最大化するレベルのスキルを達成するには、調査官の忍耐と実践が必要です。ここに示されているアフリカマラリア蚊の胚のマイクロインジェクションのための方法です, アノフェレスガンビア .目的は、開発中の生殖細胞(極)細胞で取り上げることができるように、胚に外因性DNAをマイクロインジェクションで送達することです。トランスポザース、インテグラーゼ、リコンビナーセ、または他のヌクレアーゼ(CRISPR関連タンパク質、Casなど)の注入されたDNAからの発現は、染色体への共有結合挿入につながる事象を引き起こす可能性があります。これらの技術から生成されたトランスジェニック An.ガンビア は、免疫系成分、摂食に関与する遺伝子、および嗅覚系の要素の基礎研究に使用されてきた。さらに、これらの技術は、マラリア原虫の伝染を制御するのに役立つ形質を有する An.ガンビア 株を産生するために使用されてきた。
Introduction
マイクロインジェクション技術は、1900年代初期から生物を実験的に操作するために使用されてきました。マイクロインジェクションは、基本的な生物学的機能の両方を研究し、望ましい生物の生物学における重要な変化を導入するために使用されてきました。マイクロインジェクション技術は、ベクター生物学者に特に興味深く、ベクターゲノム2-11を操作するために広く使用されてきた。節足動物ベクターのトランスジェネシス実験は、ベクターの適性を低下させるか、またはそれらが媒介する病原体への屈折性を高める変化を制定することによって、病原体を伝染させるベクターを効率よくなくすることを目的とすることが多い。蚊は様々なヒト病原体を媒介し、世界中の罹患率と死亡率に大きな影響を与えます。蚊のアノフェレス属は、ヒトマラリア寄生虫病原体であるプラスモジウム属を媒介する。アノフェレスの遺伝子工学実験は、生物学をよりよく理解し、新しいマラリア排除戦略を開発する取り組みにおいて、これらの蚊のベクター能力を低下させることを目的としています。
世界中で最もマラリア感染に寄与する蚊のベクターは、 アノフェレスガンビア 種複合体にあります。しかし、成功した遺伝子導入実験の大半は、インド亜大陸のマラリアベクター、 アノフェレス・ステポルシに対して行われている。実験室適応 アノフェレスガンビア株 の多くが存在するが、トランスジェニック アノフェールガンビアspp. 文献で報告されたラインは 、アノフェレスステナシのそれと比較しない。 アノフェレス・ガンビア胚 は、これらの違いの理由は不明であるが、 アノフェレス・ステナシよりも注射し、成功したトランスジェネシスを達成することはより困難であると考えられている。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介して アノフェレスガンビア 胚のトランスジェネシスを達成することに一貫して成功することが証明されている方法を記述する。このプロトコルは、エルヴェ・ボッシンとマーク・ベネディクト12 によって以前に開発された方法に基づいており、トランスジェネシスの効率を高めるために発見されたいくつかの追加の詳細と変更が加えられた。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9のような精密で柔軟な遺伝子工学技術の利用可能性が高まるとともに、トランスジェニック生物は以前より簡単で安定した方法で開発することができます。これらのツールにより、研究者は、病原体への屈折性(集団改変)または遺伝性無菌(集団抑制)のいずれかの所望の特性を達成するのに非常に近い蚊ベクターのトランスジェニック株を作成することができました。しかし、可能な?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ドルシラ・スティリンジャー、キオナ・パーカー、パリッシュ・パウエル、マデリーン・トトリの蚊の夫に感謝しています。資金は、カリフォルニア大学アーバインマラリアイニシアチブによって提供されました。AAJはカリフォルニア大学アーバイン校のドナルド・ブレン教授です。
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Riferimenti
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
