아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법
Summary
미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
배아 미세 주입 기술은 곤충 종의 많은 분자 및 유전 연구에 필수적입니다. 그(것)들은 안정적이고 헤아린 방식으로 곤충 생식선으로 유리한 특성뿐만 아니라 관심있는 유전자를 인코딩하는 외인성 DNA 단편을 소개하는 수단을 제공합니다. 결과 형질전환균은 기본적인 질문에 대답하거나 실제 응용분야에서 사용되는 통합 된 DNA의 발현으로 인한 표현성 변화를 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 간단하지만 효율성을 극대화하는 수준의 기술을 달성하기 위해서는 조사자의 인내와 연습이 필요합니다. 여기에 표시 아프리카 말라리아 모기의 배아의 미세 주입을위한 방법이다, Anopheles 감비아. 목표는 개발 된 생식선 (극) 세포에서 채택 될 수 있도록 배아에 미세 주입 외인성 DNA에 의해 전달하는 것입니다. 트랜스포지아제, 정수, 재조합, 또는 기타 뉴클레아제(예: CRISPR 관련 단백질, Cas)의 주입된 DNA로부터 발현은 염색체로의 공유 삽입으로 이어지는 이벤트를 유발할 수 있다. 이러한 기술에서 생성된 트랜스제닉 An. 감비아는 면역 계통 구성 요소, 혈액 공급에 관여하는 유전자 및 후각 시스템의 요소에 대한 기본 연구에 사용되었습니다. 또한, 이러한 기술은 말라리아 기생충의 전송을 통제하는 것을 도울 수 있는 특성을 가진 An. 감비아인 긴장을 생성하는 데 이용되었습니다.
Introduction
미세 주입 기술은 1900년대 초부터 유기체를 실험적으로조작하는 데 사용되어 왔다. 미세 주입은 기본적인 생물학적 기능을 연구하고 원하는 유기체의 생물학에 중요한 변화를 도입하는 데 사용되었습니다. 미세 주입 기술은 벡터 생물학자에게 특히 관심이 있었으며 벡터 게놈2-11을조작하는 데 널리 사용되어 왔다. 절지동물 벡터의 트랜스게네스 실험은 종종 벡터의 체력을 감소시키거나 전달되는 병원체에 대한 내화성을 증가시키는 변화를 제정함으로써 병원균을 전송하는 데 벡터를 덜 효율적으로 만드는 것을 목표로 합니다. 모기는 다양한 인간 병원체를 전송하고 전 세계적으로 이환율과 사망률에 중요한 영향을 미칩니다. 모기의 아노페스 속은 인간 말라리아 기생 병원균, 플라스모듐 spp를 전송합니다. Anopheles를 가진 유전 공학 실험은 생물학을 더 잘 이해하고 새로운 말라리아 제거 전략을 개발하기 위한 노력에 있는 이 모기의 벡터 용량을 감소시키는 것을 목표로 했습니다.
전 세계적으로 가장 말라리아 감염을 기여하는 모기 벡터는 Anopheles 감비아 종 복합체에 있습니다. 그러나, 성공적인 유전자 실험의 대다수는 인도 아대륙의 말라리아 벡터에, Anopheles stephensi에수행되었습니다. 실험실 적응 Anopheles 감비아균의 많음이 존재하는 동안, 형질전환 Anopheles 감비아의 수는. 이 다름에 대한 이유는 알려지지 않았지만, Anopheles 감비아배아는 Anopheles stephensi보다성공적인 전염을 주입하고 달성하기가 더 어렵다고 생각됩니다. 이 프로토콜은 미세 주입을 통해 Anopheles 감비아아아의 전염을 달성하는 데 지속적으로 성공한 것으로 입증된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 Hervé Bossin과 마크 베네딕트(12)에 의해 개발 된 방법을 기반으로하고 몇 가지 추가 세부 사항 및 변경은 과기 생성의 효율성을 높이기 위해 발견 된 추가.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9와 같은 정밀하고 유연한 유전 공학 기술의 가용성이 증가함에 따라 형질 전환 생물은 이전보다 보다 간단하고 안정적인 방식으로 개발될 수 있습니다. 이 공구는 연구원이 병원체 (인구 수정) 또는 헤아릴 수 있는 불임 (인구 억제)에 내화성의 원하는 속성을 달성에 아주 가까운 모기 벡터의 형질전환균을 만들 수 있었습니다. 그러나 가장 안전하고 안정적인 유전자 변형 모기를 개발하기…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
드루실라 스틸링거, 키오나 파커, 패리시 파월, 매들린 노톨리에게 모기 축산에 감사드립니다. 기금은 캘리포니아 대학, 어바인 말라리아 이니셔티브에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Riferimenti
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
