Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi
Summary
Mikroenjeksiyon teknikleri, sivrisineklerin genomlarına eksojen genleri sokmak için gereklidir. Bu protokol, James laboratuvarı tarafından DNA yapılarını dönüştürülmüş sivrisinekler üretmek için Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeze etmek için kullanılan bir yöntemi açıklar.
Abstract
Embriyo mikroenjeksiyon teknikleri böcek türlerinin birçok moleküler ve genetik çalışması için gereklidir. İlgi genlerini kodlayan eksojen DNA parçalarının yanı sıra böcek germline olumlu özellikleri istikrarlı ve kalıtsal bir şekilde tanıtmak için bir araç sağlarlar. Ortaya çıkan transgenik suşlar, temel soruları yanıtlamak için entegre DNA’nın ifadesinden kaynaklanan veya pratik uygulamalarda kullanılan fenotipik değişiklikler için incelenebilir. Teknoloji basit olmasına rağmen, verimliliği en üst düzeye çıkaran bir beceri seviyesine ulaşmak için araştırmacı sabrı ve uygulaması gerekir. Burada gösterilen Afrika sıtma sivrisinek embriyolarının mikroenjeksiyonu için bir yöntemdir, Anopheles gambiae. Amaç, gelişmekte olan mikromline (kutup) hücrelerinde alınabilmesi için embriyoya mikroenjeksiyon eksojen DNA ile teslim etmektir. Transposazların, integrazların, rekombinazların veya diğer nükleazların enjekte edilen DNA’sından (örneğin CRISPR ilişkili proteinler, Cas) gelen ifade, kromozomlara kovalent yerleştirilmesine yol açan olayları tetikleyebilir. Bu teknolojilerden üretilen Transgenik An. gambiae, bağışıklık sistemi bileşenlerinin, kan beslemede rol oynayan genlerin ve koku sisteminin elemanlarının temel çalışmaları için kullanılmıştır. Ek olarak, bu teknikler sıtma parazitlerinin bulaşmasını kontrol etmeye yardımcı olabilecek özelliklere sahip An. gambiae suşları üretmek için kullanılmıştır.
Introduction
Mikroenjeksiyon teknikleri 1900’lerin başından beri organizmaları deneysel olarak manipüle etmek için kullanılmaktadır1. Mikroenjeksiyon, hem temel biyolojik fonksiyonları incelemek hem de istenen bir organizmanın biyolojisinde önemli değişiklikler sağlamak için kullanılmıştır. Mikroenjeksiyon tekniği vektör biyologlarının özellikle ilgisini çekmiştir ve vektör genomlarını manipüle etmek için yaygın olarak kullanılmıştır2-11. Eklembacaklı vektörlerdeki transgenez deneyleri genellikle vektörün kondisyonını azaltan veya ilettikleri patojenlere refrakterliği artıran değişiklikleri yürürlüğe koyarak vektörleri patojenlerin iletiminde daha az verimli hale getirmeyi amaçlamaktadır. Sivrisinekler çeşitli insan patojenlerini iletir ve dünya çapında morbidite ve mortalite üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Sivrisineklerin Anopheles cinsi, insan sıtma parazit patojenleri plasmodium spp’yi iletir. Anopheles ile yapılan genetik mühendislik deneyleri, yeni sıtma eliminasyon stratejileri geliştirme çabalarında biyolojiyi daha iyi anlamayı ve bu sivrisineklerin vektörel kapasitesini azaltmayı amaçladılar.
Dünya çapında en fazla sıtma enfeksiyonuna katkıda bulunan sivrisinek vektörleri Anopheles gambiae türleri kompleksindedir. Bununla birlikte, başarılı transgenez deneylerinin çoğu Hint alt kıtasının sıtma vektörü anopheles stephensiüzerinde gerçeklenmiştir. Laboratuvara uyarlanmış birçok Anopheles gambiae suşu mevcut olsa da, literatürde bildirilen transgenik Anopheles gambiae spp. çizgilerinin sayısı Anopheles stephensiile karşılaştırılamaz. Anopheles gambiae embriyosuna enjekte etmenin ve başarılı transgenez elde etmenin Anopheles stephensi‘den daha zor olduğu düşünülmektedir Bu farklılıkların nedenleri bilinmemekle birlikte. Bu protokol, Mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles gambiae embriyolarının transgenezini elde etmede sürekli olarak başarılı olduğu kanıtlanmış bir yöntemi açıklar. Protokol, daha önce Hervé Bossin ve Mark Benedict12 tarafından geliştirilen ve transgenezin verimliliğini artırdığı tespit edilen bazı ek ayrıntılar ve değişikliklerle birlikte geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 gibi hassas ve esnek genetik mühendislik teknolojilerinin kullanılabilirliğinin artmasıyla transgenik organizmalar daha önce mümkün olandan daha basit ve istikrarlı bir şekilde geliştirilebilir. Bu araçlar, araştırmacıların patojenlere (popülasyon modifikasyonu) veya kalıtsal steriliteye (popülasyon bastırma) refrakterliğin istenen özelliklerini elde etmeye çok yakın olan sivrisinek vektörlerinin transgenik suşlarını oluşturmalarına izin verdi. Bununla birlikte, mümkün olan en g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sivrisinek hayvancılığı için Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell ve Madeline Nottoli’ye minnettarız. Fon, Kaliforniya Üniversitesi, Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi’nde Donald Bren Profesörüdür.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
Riferimenti
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
