マウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用
Summary
硬化中の歯科用セメントの収縮は、ベースプレートを変位させます。このプロトコルは、ベースプレートをセメントで固めるスペースを残す歯科用セメントの初期基礎を作成することにより、問題を最小限に抑えます。数週間後、ベースプレートは、ほとんど新しいセメントを使用してこの足場の所定の位置にセメントで固定できるため、収縮が減少します。
Abstract
神経科学者は、小型顕微鏡(ミニスコープ)を使用して、自由に行動する動物の神経活動を観察します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームは、研究者が自分でミニスコープを構築するためのオープンリソースを提供しています。V3 UCLAミニスコープは、現在使用されている最も人気のあるオープンソースミニスコープの1つです。表在皮質に埋め込まれた対物レンズ(1レンズシステム)を介して遺伝子組み換えニューロンから放出される蛍光トランジェントのイメージング、または脳深部に埋め込まれたリレーレンズとミニスコープに事前に固定された対物レンズの組み合わせ(2レンズシステム)を介して、脳深部領域のイメージングを可能にします。最適な条件下(ニューロンが蛍光インジケーターを発現し、リレーレンズが適切に埋め込まれている場合)でも、セメント硬化時にベースプレートと頭蓋骨への付着との間の歯科用セメントの体積変化により、対物レンズとリレーレンズの間の距離が変化してずれ、画質が低下する可能性があります。ベースプレートは、ミニスコープを頭蓋骨に取り付け、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離を固定するのに役立つプレートです。したがって、ベースプレートの周りの歯科用セメントの体積の変化は、レンズ間の距離を変化させる。本プロトコルは、歯科用セメントの体積変化によって引き起こされるミスアライメントの問題を最小限に抑えることを目的としています。このプロトコルは、リレーレンズの埋め込み中に歯科用セメントの初期基礎を構築することにより、ミスアライメントを低減します。移植後の回復時間は、歯科用セメントの基礎がベースプレートを完全に硬化させるのに十分であるため、できるだけ少ない新しいセメントを使用して、ベースプレートをこの足場にセメントで固定できます。本稿では、ミニスコープに固定された対物レンズで神経活動のイメージングを可能にするマウスのベースプレーティング戦略について説明します。
Introduction
蛍光活性レポーターは、感度が高く、ダイナミックレンジが大きいため、ニューロン活動のイメージングに最適です1,2,3。そのため、蛍光顕微鏡を使用して神経活動を直接観察する実験が増えています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。最初の小型化された一光子蛍光顕微鏡(ミニスコープ)は、2011年にMark Schnitzerらによって設計されました5。このミニスコープにより、研究者は自由に行動する動物5の小脳細胞の蛍光ダイナミクスをモニターできます(つまり、動物への身体的拘束、頭部拘束、鎮静、または麻酔なし)。現在、この技術は、皮質6,8,15,16などの表在脳領域を監視するために適用することができる。背海馬8,11,13,14および線条体6,17などの皮質下領域。腹側海馬14、扁桃体10,18、視床下部8,12などの脳深部領域。
近年、いくつかのオープンソースのミニスコープが開発されています4,5,6,7,11,13,17,19.ミニスコープは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームが提供する段階的なガイドラインに従っていれば、研究者が経済的に組み立てることができます。4,7,11,13.神経活動の光学的モニタリングは光透過の限界によって制限されるため7 関心のあるニューロン集団との間で、リレーGRINレンズ(またはリレーレンズ)から中継される視野を拡大するために、対物レンズ勾配屈折率(GRIN)レンズ(または対物レンズ)をミニスコープの下部に事前に固定する必要があるミニスコープが設計されました。6,7,8,10,16,17.このリレーレンズは、標的脳領域の蛍光活動がリレーレンズの表面に中継されるように、標的脳領域に埋め込まれる。6,7,8,10,16,17.正弦波周期の約1/4の光が対物レンズ(~0.25ピッチ)を通過します(図 1A1)、拡大蛍光画像が得られます6,7.対物レンズは必ずしもミニスコープの下部に固定されているわけではなく、リレーレンズの埋め込みも必要ありません。6,7,11,13,15.具体的には、ミニスコープに固定された対物レンズと脳に埋め込まれたリレーレンズの2つの構成があります。8,10,12,14,16 (図 1B1)と取り外し可能な対物レンズだけの別のレンズ6,7,11,13,15 (図 1B2).固定対物レンズと埋め込み型リレーレンズの組み合わせに基づく設計では、脳からの蛍光信号がリレーレンズの上面に運ばれます(図 1A1)7,8,10,12,14,16.その後、対物レンズは、リレーレンズの上面から視野を拡大して透過させることができます(図 1A2).一方、取り外し可能な対物レンズGRINレンズの設計はより柔軟であるため、脳へのリレーレンズの事前埋め込みは必須ではありません(図 1B2)6,7,11,13,15.取り外し可能な対物レンズ設計に基づくミニスコープを使用する場合、研究者はターゲットの脳領域にレンズを埋め込む必要がありますが、対物レンズを埋め込むこともできます6,7,11,13,15 または脳内のリレーレンズ6,7.移植用の対物レンズまたはリレーレンズの選択によって、研究者が使用しなければならないミニスコープの構成が決まります。たとえば、V3 UCLAミニスコープは、取り外し可能な対物レンズGRINレンズ設計に基づいています。研究者は、関心のある脳領域に対物レンズを直接埋め込み、「空の」ミニスコープを対物レンズに取り付けるかを選択できます。6,7,11,13,15 (一眼システム; 図 1B2)または、脳にリレーレンズを埋め込み、対物レンズで事前に固定されたミニスコープを取り付ける6,7 (2レンズシステム; 図 1B1).次に、ミニスコープは蛍光カメラとして機能し、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターによって生成されたニューロン蛍光のライブストリーム画像をキャプチャします1,2,3.ミニスコープをコンピュータに接続すると、これらの蛍光画像をコンピュータに転送し、ビデオクリップとして保存できます。研究者は、いくつかの分析パッケージで蛍光の相対的な変化を分析することにより、ニューロン活動を研究できます20,21 または、将来の分析のためにコードを記述します。
V3 UCLAミニスコープは、ユーザーが1レンズまたは2レンズシステムでニューロン活動を画像化するかどうかを決定できる柔軟性を提供します7。記録システムの選択は、ターゲット脳領域の深さとサイズに基づいています。簡単に言うと、1レンズシステムは、メーカーが特定のサイズの対物レンズしか製造していないため、表面的(深さ約2.5 mm未満)で比較的大きい(約1.8 x 1.8 mm2より大きい)領域しか撮像できません。対照的に、2レンズシステムは、任意のターゲット脳領域に適用できます。しかし、地板を接着するための歯科用セメントは、対物レンズとリレーレンズの距離が変わるとズレが発生しやすく、画質が低下します。2レンズシステムを使用する場合、最適な画像品質を達成するために、2つの作動距離を正確にターゲットにする必要があります(図1A)。これらの2つの臨界作動距離は、ニューロンとリレーレンズの底面の間、およびリレーレンズの上面と対物レンズの底面の間です(図1A1)。レンズの位置がずれたり、作動距離外にずれたりすると、イメージングに失敗します(図1C2)。対照的に、ワンレンズシステムは1つの正確な作動距離しか必要としません。しかし、対物レンズのサイズは、脳深部領域のモニタリングへの用途を制限します(ミニスコープに適合する対物レンズは約1.8~2.0mmです6,11,13,15)。したがって、マウス11、13における皮質6、15および背角アンモニス1(CA1)などの表面および比較的大きな脳領域の観察のための対物レンズの移植は制限される。さらに、背側CA1を標的とするために皮質の広い領域を吸引する必要があります11,13。脳深部領域のイメージングを妨げる1レンズ構成の制限により、市販のミニスコープシステムは対物レンズ/リレーレンズ(2レンズ)を組み合わせた設計のみを提供します。一方、V3 UCLAミニスコープは、対物レンズが取り外し可能であるため、1レンズまたは2レンズのいずれかのシステムに変更することができます6,11,13,15。つまり、V3 UCLAミニスコープのユーザーは、脳の表面観察(深さ2.5 mm未満)を含む実験を行うときに、脳に埋め込む(ワンレンズシステムを作成する)、またはミニスコープに事前に固定してリレーレンズを脳に埋め込む(2レンズシステムを作成する)ことで、取り外し可能なレンズを利用できます。 脳深部観察を含む実験を行う場合。2レンズシステムは脳の表面観察にも適用できますが、研究者は対物レンズとリレーレンズの間の正確な作動距離を知っている必要があります。1レンズシステムの主な利点は、2レンズシステムで最適な画像品質を達成するために正確にターゲットを絞る必要がある2つの作動距離があることを考えると、2レンズシステムよりも作動距離を逃す可能性が低いことです(図1A)。したがって、表面的な脳の観察にはワンレンズシステムを使用することをお勧めします。ただし、実験で脳深部でのイメージングが必要な場合、研究者は2つのレンズのずれを回避することを学ぶ必要があります。
実験用ミニスコープの2レンズ構成の基本プロトコルには、レンズの埋め込みとベースメッキが含まれます8,10,16,17。ベースプレーティングとは、ベースプレートを動物の頭に接着して、ミニスコープを最終的に動物の上に取り付け、ニューロンの蛍光信号をビデオテープに収めることです(図1B)。この手順では、歯科用セメントを使用してベースプレートを頭蓋骨に接着しますが(図1C)、歯科用セメントの収縮は、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離に許容できない変化を引き起こす可能性があります8,17。2つのレンズ間の距離が大きすぎると、セルに焦点を合わせることができません。
ミニスコープを用いた脳深部カルシウムイメージング実験の詳細なプロトコルはすでに公開されています8,10,16,17.これらのプロトコルの作成者は、Inscopixシステムを使用しています8,10,16 または他のカスタマイズされたデザイン17 ウイルスの選択、手術、およびベースプレートの付着に関する実験手順について説明しました。ただし、それらのプロトコルは、V3 UCLAミニスコープシステム、NINscopeなどの他のオープンソースシステムに正確に適用することはできません。6、およびフィンチスコープ19.2つのレンズのミスアライメントは、ベースプレートを頭蓋骨にセメントで固定するために使用される歯科用セメントの種類が原因で、UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成での記録中に発生する可能性があります。8,17 (図 1C).本プロトコルが必要なのは、埋込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離が、ベースプレーティング手順中の歯科用セメントの望ましくない収縮のためにシフトする傾向があるためです。ベースプレーティングでは、ミニスコープとリレーレンズの上部の間の距離を調整して、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の最適な作動距離を見つける必要があり、この理想的な位置にベースプレートを接着する必要があります。対物レンズと埋め込みリレーレンズの正しい距離を設定すると、セル分解能(図 1B; in vivo 録音)。リレーレンズの作動距離の最適範囲が小さいため(50〜350μm)4,8、硬化中の過度のセメント収縮は、対物レンズと埋め込みリレーレンズを適切な範囲内に保つことを困難にする可能性があります。このレポートの全体的な目標は、収縮の問題を減らすためのプロトコルを提供することです。8,17 ベースプレーティング手順中に発生し、2レンズ構成での蛍光信号のミニスコープ記録の成功率を高めます。成功したミニスコープ記録は、自由に行動する動物における個々のニューロンの蛍光の顕著な相対的変化のライブストリームの記録として定義されます。歯科用セメントのブランドが異なれば収縮率は異なりますが、研究者は以前にテストされたブランドを選択できます6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22.ただし、一部の国/地域では、医療材料の輸入規制により、すべてのブランドを簡単に入手できるわけではありません。したがって、利用可能な歯科用セメントの収縮率をテストする方法を開発し、重要なことに、収縮の問題を最小限に抑える代替プロトコルを提供します。現在のベースプレーティングプロトコルに対する利点は、実験室で簡単に入手できるツールとセメントを使用したカルシウムイメージングの成功率の向上です。例としてUCLAミニスコープが使用されますが、プロトコルは他のミニスコープにも適用できます。このレポートでは、最適化されたベースメッキ手順について説明し、UCLAミニスコープ2レンズシステム(図 2A).UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成の移植成功例(n=3匹)と移植失敗例(n=2匹)を、成功と失敗の理由について議論とともに紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本報告では、2レンズUCLAミニスコープシステムを使用する研究者向けの詳細な実験プロトコルについて説明します。私たちのプロトコルで設計されたツールは、 in vivo カルシウムイメージングを試したい研究室にとって比較的手頃な価格です。ウイルス注入、レンズ埋め込み、ダミーベースメッキ、ベースメッキなどの一部のプロトコルは、カルシウムイメージングの成功率を向上さ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、台湾科学技術部(108-2320-B-002 -074、109-2320-B-002-023-MY2)の支援を受けました。
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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