Uso de placas base y un miniscopio preanclado con una lente objetiva para la investigación transitoria de calcio en ratones
Summary
La contracción del cemento dental durante el curado desplaza la placa base. Este protocolo minimiza el problema al crear una base inicial del cemento dental que deja espacio para cementar la placa base. Semanas más tarde, la placa base se puede cementar en posición en este andamio con poco cemento nuevo, reduciendo así la contracción.
Abstract
Los neurocientíficos usan microscopios en miniatura (miniscopios) para observar la actividad neuronal en animales que se comportan libremente. El equipo de Miniscopios de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) proporciona recursos abiertos para que los investigadores construyan miniscopios ellos mismos. El V3 UCLA Miniscope es uno de los miniscopios de código abierto más populares actualmente en uso. Permite obtener imágenes de los transitorios de fluorescencia emitidos por neuronas modificadas genéticamente a través de una lente objetiva implantada en la corteza superficial (un sistema de una lente), o en áreas cerebrales profundas a través de una combinación de una lente de relé implantada en el cerebro profundo y una lente objetiva que está preanclada en el miniscopio para observar la imagen transmitida (un sistema de dos lentes). Incluso en condiciones óptimas (cuando las neuronas expresan indicadores de fluorescencia y la lente del relé se ha implantado correctamente), un cambio de volumen del cemento dental entre la placa base y su unión al cráneo tras el curado con cemento puede causar una desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Una placa base es una placa que ayuda a montar el miniscopio en el cráneo y fija la distancia de trabajo entre el objetivo y las lentes del relé. Por lo tanto, los cambios en el volumen del cemento dental alrededor de la placa base alteran la distancia entre las lentes. El presente protocolo tiene como objetivo minimizar el problema de desalineación causado por los cambios de volumen en el cemento dental. El protocolo reduce la desalineación mediante la construcción de una base inicial de cemento dental durante la implantación de lentes de relé. El tiempo de convalecencia después de la implantación es suficiente para que la base del cemento dental cure completamente la placa base, por lo que la placa base se puede cementar en este andamio utilizando la menor cantidad de cemento nuevo posible. En el presente artículo, describimos estrategias para el recubrimiento de base en ratones para permitir la obtención de imágenes de la actividad neuronal con una lente objetiva anclada en el miniscopio.
Introduction
Los reporteros de actividad fluorescente son ideales para obtener imágenes de la actividad neuronal porque son sensibles y tienen grandes rangos dinámicos 1,2,3. Por lo tanto, un número creciente de experimentos están utilizando microscopía de fluorescencia para observar directamente la actividad neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. El primer microscopio de fluorescencia miniaturizado de un fotón (miniscopio) fue diseñado en 2011 por Mark Schnitzer et al.5. Este miniscopio permite a los investigadores monitorear la dinámica de fluorescencia de las células cerebelosas en animales que se comportan libremente5 (es decir, sin ninguna restricción física, restricción de la cabeza, sedación o anestesia para los animales). Actualmente, la técnica se puede aplicar para monitorear áreas cerebrales superficiales como la corteza 6,8,15,16; áreas subcorticales como el hipocampo dorsal 8,11,13,14 y el cuerpo estriado 6,17; y áreas cerebrales profundas como el hipocampo ventral 14, la amígdala 10,18 y el hipotálamo 8,12.
En los últimos años, se han desarrollado varios miniscopios de código abierto.4,5,6,7,11,13,17,19. El miniscopio puede ser ensamblado económicamente por los investigadores si siguen las pautas paso a paso proporcionadas por el equipo de Miniscopio de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA).4,7,11,13. Porque el monitoreo óptico de la actividad neuronal está restringido por las limitaciones de la transmisión de la luz7 hacia y desde la población neuronal de interés, se diseñó un miniscopio que requiere que una lente de índice de refracción de gradiente objetivo (GRIN) (o lente objetiva) se ancle previamente en la parte inferior del miniscopio para ampliar el campo de visión que se transmite desde una lente GRIN de relé (o lente de relé)6,7,8,10,16,17. Esta lente de relé se implanta en la región del cerebro objetivo de tal manera que la actividad de fluorescencia de la región del cerebro objetivo se transmite a la superficie de la lente de relé.6,7,8,10,16,17. Aproximadamente 1/4 de un período sinusoidal completo de luz viaja a través de la lente GRIN del objetivo (~ 0.25 tono) (Figura 1A1), lo que da como resultado una imagen de fluorescencia ampliada6,7. La lente del objetivo no siempre se fija en la parte inferior del miniscopio ni es necesaria la implantación de la lente del relé6,7,11,13,15. Específicamente, hay dos configuraciones: una con una lente de objetivo fijo en el miniscopio y una lente de relé implantada en el cerebro.8,10,12,14,16 (Figura 1B1) y otro con solo una lente de objetivo extraíble6,7,11,13,15 (Figura 1B2). En el diseño basado en el objetivo fijo y la combinación de lente de relé implantada, las señales de fluorescencia del cerebro se llevan a la superficie superior de la lente de relé (Figura 1A1)7,8,10,12,14,16. Posteriormente, la lente del objetivo puede ampliar y transmitir el campo visual desde la superficie superior de la lente del relé (Figura 1A2). Por otro lado, el diseño de la lente GRIN de objetivo extraíble es más flexible, lo que significa que la preimplantación de una lente de relé en el cerebro no es obligatoria (Figura 1B2)6,7,11,13,15. Cuando se usa un miniscopio basado en un diseño de lente objetivo extraíble, los investigadores aún necesitan implantar una lente en la región del cerebro objetivo, pero pueden implantar una lente objetiva.6,7,11,13,15 o una lente de relé en el cerebro6,7. La elección de un objetivo o una lente de relé para la implantación determina la configuración del miniscopio que el investigador debe utilizar. Por ejemplo, el V3 UCLA Miniscope se basa en un diseño de lente GRIN objetivo extraíble. Los investigadores pueden elegir entre implantar directamente una lente objetiva en la región del cerebro de interés y montar el miniscopio “vacío” en la lente del objetivo.6,7,11,13,15 (un sistema de una lente; Figura 1B2) o para implantar una lente de relé en el cerebro y montar un miniscopio que está preanclado con una lente objetiva6,7 (un sistema de dos lentes; Figura 1B1). El miniscopio luego funciona como una cámara de fluorescencia para capturar imágenes en vivo de la fluorescencia neuronal producida por un indicador de calcio codificado genéticamente.1,2,3. Después de conectar el miniscopio a una computadora, estas imágenes de fluorescencia se pueden transferir a la computadora y guardar como videoclips. Los investigadores pueden estudiar la actividad neuronal analizando los cambios relativos en la fluorescencia con algunos paquetes de análisis.20,21 o escribir sus códigos para futuros análisis.
El V3 UCLA Miniscope proporciona flexibilidad para que los usuarios determinen si desean obtener imágenes de la actividad neuronal con un sistema de una o dos lentes7. La elección del sistema de grabación se basa en la profundidad y el tamaño del área del cerebro objetivo. En resumen, un sistema de una lente solo puede obtener imágenes de un área superficial (menos de aproximadamente 2.5 mm de profundidad) y relativamente grande (más grande que aproximadamente 1.8 x 1.8 mm2) porque los fabricantes solo producen un cierto tamaño de lente objetiva. Por el contrario, se puede aplicar un sistema de dos lentes a cualquier área del cerebro objetivo. Sin embargo, el cemento dental para pegar la placa base tiende a causar desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Si se utiliza el sistema de dos lentes, es necesario orientar con precisión dos distancias de trabajo para lograr la calidad de imagen óptima (Figura 1A). Estas dos distancias críticas de trabajo son entre las neuronas y la superficie inferior de la lente del relé, y entre la superficie superior de la lente del relé y la superficie inferior de la lente del objetivo (Figura 1A1). Cualquier desalineación o colocación incorrecta de la lente fuera de la distancia de trabajo da como resultado una falla de imagen (Figura 1C2). Por el contrario, el sistema de una lente requiere solo una distancia de trabajo precisa. Sin embargo, el tamaño de la lente del objetivo limita su aplicación para el monitoreo de regiones cerebrales profundas (la lente del objetivo que se ajusta al miniscopio es aproximadamente 1.8 ~ 2.0 mm 6,11,13,15). Por lo tanto, la implantación de una lente objetiva es limitada para la observación de la superficie y regiones cerebrales relativamente grandes, como la corteza 6,15 y la cornu ammonis dorsal 1 (CA1) en ratones11,13 . Además, se debe aspirar una gran área de la corteza para apuntar al CA1 dorsal11,13. Debido a la limitación de la configuración de una lente que impide la obtención de imágenes de regiones cerebrales profundas, los sistemas de miniscopio comerciales ofrecen solo un diseño combinado de lente / lente de relé objetivo (dos lentes). Por otro lado, el miniscopio V3 UCLA se puede modificar en un sistema de una o dos lentes porque su lente objetivo es extraíble 6,11,13,15. En otras palabras, los usuarios del miniscopio V3 UCLA pueden aprovechar la lente extraíble implantándola en el cerebro (creando un sistema de una lente), al realizar experimentos que involucran observaciones cerebrales superficiales (menos de 2.5 mm de profundidad), o preanclarla en el miniscopio e implantar una lente de relé en el cerebro (creando un sistema de dos lentes), al realizar experimentos que involucran observaciones cerebrales profundas. El sistema de dos lentes también se puede aplicar para observar superficialmente el cerebro, pero el investigador debe conocer las distancias de trabajo precisas entre la lente del objetivo y la lente del relé. La principal ventaja del sistema de una lente es que hay una menor probabilidad de perder las distancias de trabajo que con un sistema de dos lentes, dado que hay dos distancias de trabajo que deben orientarse con precisión para lograr una calidad de imagen óptima en el sistema de dos lentes (Figura 1A). Por lo tanto, recomendamos usar un sistema de una lente para observaciones cerebrales superficiales. Sin embargo, si el experimento requiere imágenes en el área profunda del cerebro, el investigador debe aprender a evitar la desalineación de las dos lentes.
El protocolo básico para la configuración de dos lentes de miniscopios para experimentos incluye la implantación de lentes y el revestimiento base 8,10,16,17. El recubrimiento base es el pegado de una placa base en la cabeza de un animal para que el miniscopio pueda montarse eventualmente en la parte superior del animal y grabar en video las señales de fluorescencia de las neuronas (Figura 1B). Este procedimiento implica el uso de cemento dental para pegar la placa base en el cráneo (Figura 1C), pero la contracción del cemento dental puede causar cambios inaceptables en la distancia entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo 8,17. Si la distancia desplazada entre las dos lentes es demasiado grande, las células no se pueden enfocar.
Ya se han publicado protocolos detallados para experimentos de imágenes profundas de calcio cerebral utilizando miniscopios8,10,16,17. Los autores de estos protocolos han utilizado el sistema Inscopix8,10,16 u otros diseños personalizados17 y han descrito los procedimientos experimentales para la selección viral, la cirugía y la fijación de la placa base. Sin embargo, sus protocolos no se pueden aplicar con precisión a otros sistemas de código abierto, como el sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope.6, y Finchscope19. La desalineación de las dos lentes puede ocurrir durante la grabación en una configuración de dos lentes con un miniscopio UCLA debido al tipo de cemento dental que se utiliza para cementar la placa base al cráneo.8,17 (Figura 1C). El protocolo actual es necesario porque la distancia entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo es propensa a cambiar debido a la contracción indeseable del cemento dental durante el procedimiento de recubrimiento base. Durante el recubrimiento base, la distancia de trabajo óptima entre la lente de relé implantada y la lente del objetivo debe encontrarse ajustando la distancia entre el miniscopio y la parte superior de la lente del relé, y la placa base debe pegarse en esta ubicación ideal. Después de ajustar la distancia correcta entre la lente del objetivo y la lente de relé implantada, se pueden obtener mediciones longitudinales a resolución celular (Figura 1B; in vivo grabación). Dado que el rango óptimo de distancias de trabajo de una lente de relé es pequeño (50 – 350 μm)4,8, la contracción excesiva del cemento durante el curado puede dificultar mantener la lente del objetivo y la lente de relé implantada dentro del rango apropiado. El objetivo general de este informe es proporcionar un protocolo para reducir los problemas de contracción.8,17 que ocurren durante el procedimiento de recubrimiento base y para aumentar la tasa de éxito de las grabaciones de miniscopio de señales de fluorescencia en una configuración de dos lentes. La grabación exitosa de miniscopios se define como la grabación de una transmisión en vivo de cambios relativos notables en la fluorescencia de neuronas individuales en un animal que se comporta libremente. Aunque las diferentes marcas de cemento dental tienen diferentes tasas de contracción, los investigadores pueden seleccionar una marca que haya sido probada previamente.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Sin embargo, no todas las marcas son fáciles de obtener en algunos países / regiones debido a las regulaciones de importación de materiales médicos. Por lo tanto, hemos desarrollado métodos para probar las tasas de contracción de los cementos dentales disponibles y, lo que es más importante, proporcionar un protocolo alternativo que minimice el problema de contracción. La ventaja sobre el protocolo de recubrimiento base actual es un aumento en la tasa de éxito de las imágenes de calcio con herramientas y cemento que se pueden obtener fácilmente en los laboratorios. El miniscopio UCLA se utiliza como ejemplo, pero el protocolo también es aplicable a otros miniscopios. En este informe, describimos un procedimiento de revestimiento base optimizado y también recomendamos algunas estrategias para ajustar el sistema de dos lentes del miniscopio UCLA (Figura 2A). Tanto los ejemplos de implantación exitosa (n = 3 ratones) como los ejemplos de implantación fallida (n = 2 ratones) para la configuración de dos lentes con el miniscopio UCLA se presentan junto con las discusiones sobre las razones de los éxitos y fracasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente informe describe un protocolo experimental detallado para los investigadores que utilizan el sistema de miniscopio UCLA de dos lentes. Las herramientas diseñadas en nuestro protocolo son relativamente asequibles para cualquier laboratorio que desee probar imágenes de calcio in vivo . Algunos protocolos, como la inyección viral, la implantación de lentes, el recubrimiento base ficticio y el recubrimiento base, también podrían usarse para otras versiones del sistema de miniscopio para mejorar la …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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