Bruk av baseplating og et miniskop forankret med en objektiv linse for kalsiumforbigående forskning hos mus
Summary
Krympingen av dental sement under herding forskyver grunnplaten. Denne protokollen minimerer problemet ved å skape et første fundament av tannsementen som gir plass til å sementere grunnplaten. Noen uker senere kan bunnplaten sementeres på plass på dette stillaset ved hjelp av lite ny sement, og dermed redusere krympingen.
Abstract
Nevrologer bruker miniatyrmikroskoper (miniskoper) for å observere nevronaktivitet hos dyr som oppfører seg fritt. University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet gir åpne ressurser for forskere å bygge miniskoper selv. V3 UCLA Miniscope er et av de mest populære open source-miniskopene som er i bruk. Det tillater avbildning av fluorescenstransienter som sendes ut fra genetisk modifiserte nevroner gjennom en objektiv linse implantert på overfladisk cortex (et linsesystem), eller i dype hjerneområder gjennom en kombinasjon av en relélinse implantert i den dype hjernen og en objektivlinse som er forankret i miniskopet for å observere det videresendte bildet (et to-linsesystem). Selv under optimale forhold (når nevroner uttrykker fluorescensindikatorer og relélinsen er riktig implantert), kan en volumendring av tannsementen mellom baseplaten og dens feste til skallen ved sementherding forårsake feiljustering med en endret avstand mellom objektiv- og relélinsene, noe som resulterer i dårlig bildekvalitet. En baseplate er en plate som hjelper til med å montere miniskopet på skallen og fikser arbeidsavstanden mellom objektivet og relélinsene. Dermed endrer endringer i volumet av dental sement rundt grunnplaten avstanden mellom linsene. Den nåværende protokollen tar sikte på å minimere feiljusteringsproblemet forårsaket av volumendringer i tannsementen. Protokollen reduserer feiljusteringen ved å bygge et første fundament av tannsement under relélinseimplantasjon. Rekonvalesenstiden etter implantasjon er tilstrekkelig til at fundamentet av tannsement kan herde bunnplaten helt, slik at grunnplaten kan sementeres på dette stillaset med så lite ny sement som mulig. I denne artikkelen beskriver vi strategier for baseplettering hos mus for å muliggjøre avbildning av nevronaktivitet med en objektiv linse forankret i miniskopet.
Introduction
Fluorescerende aktivitetsreportere er ideelle for avbildning av nevronaktiviteten fordi de er følsomme og har store dynamiske områder 1,2,3. Derfor bruker et økende antall eksperimenter fluorescensmikroskopi for direkte å observere nevronaktivitet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Det første miniatyriserte en-foton fluorescensmikroskopet (miniskop) ble designet i 2011 av Schnitzer et al.5. Dette miniskopet gjør det mulig for forskere å overvåke fluorescensdynamikken til cerebellarceller i fritt oppførende dyr5 (dvs. uten fysisk begrensning, hodestøtte, sedasjon eller anestesi til dyrene). For tiden kan teknikken brukes til å overvåke overfladiske hjerneområder som cortex 6,8,15,16; subkortikale områder som dorsal hippocampus 8,11,13,14 og striatum 6,17; og dype hjerneområder som ventral hippocampus 14, amygdala 10,18 og hypothalamus 8,12.
De siste årene har flere open source-miniskoper blitt utviklet4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskopet kan settes sammen økonomisk av forskere hvis de følger trinnvise retningslinjer gitt av University of California, Los Angeles (UCLA) Miniscope-teamet4,7,11,13. Fordi optisk overvåking av nevral aktivitet er begrenset av begrensningene i lysoverføring7 til og fra den nevrale populasjonen av interesse, ble et miniskop designet som krever at en objektiv gradientbrytningsindeks (GRIN) linse (eller objektivlinse) skal forankres nederst i miniskopet for å forstørre synsfeltet som videresendes fra et relé GRIN-objektiv (eller relélinse)6,7,8,10,16,17. Denne relélinsen er implantert i målhjerneområdet slik at fluorescensaktiviteten til målhjerneområdet blir videresendt på overflaten av relélinsen6,7,8,10,16,17. Omtrent 1/4 av en full sinusformet periode med lys beveger seg gjennom den objektive GRIN-linsen (~ 0,25 tonehøyde) (Figur 1A1), noe som resulterer i et forstørret fluorescensbilde6,7. Objektivlinsen er ikke alltid festet i bunnen av miniskopet, og implantasjonen av relélinsen er heller ikke nødvendig6,7,11,13,15. Spesielt er det to konfigurasjoner: en med en fast objektivlinse i miniskopet og en relélinse implantert i hjernen8,10,12,14,16 (Figur 1B1) og en annen med bare en flyttbar objektivlinse6,7,11,13,15 (Figur 1B2). I designet basert på kombinasjonen av fast mål og implantert relélinse, bringes fluorescenssignalene fra hjernen til den øverste overflaten av relélinsen (Figur 1A1)7,8,10,12,14,16. Deretter kan objektivlinsen forstørre og overføre synsfeltet fra den øverste overflaten av relélinsen (Figur 1A2). På den annen side er den flyttbare objektive GRIN-linsedesignen mer fleksibel, noe som betyr at preimplantasjon av en relélinse i hjernen ikke er obligatorisk (Figur 1B2)6,7,11,13,15. Når du bruker et miniskop basert på en flyttbar objektivlinsedesign, trenger forskere fortsatt å implantere en linse i målhjerneområdet, men de kan enten implantere en objektivlinse6,7,11,13,15 eller en relélinse i hjernen6,7. Valget av et mål eller en relélinse for implantasjon bestemmer miniskopkonfigurasjonen som forskeren må bruke. For eksempel er V3 UCLA Miniscope basert på en flyttbar objektiv GRIN-linsedesign. Forskere kan velge å enten implantere en objektiv linse direkte i hjerneområdet av interesse og montere det “tomme” miniskopet på objektivlinsen6,7,11,13,15 (et system med ett objektiv; Figur 1B2) eller å implantere en relélinse i hjernen og montere et miniskop som er forankret med en objektivlinse6,7 (et system med to linser; Figur 1B1). Miniskopet fungerer deretter som et fluorescenskamera for å fange livestream-bilder av nevronfluorescens produsert av en genetisk kodet kalsiumindikator1,2,3. Etter at miniskopet er koblet til en datamaskin, kan disse fluorescensbildene overføres til datamaskinen og lagres som videoklipp. Forskere kan studere nevronaktivitet ved å analysere de relative endringene i fluorescens med noen analysepakker20,21 eller skriv kodene deres for fremtidig analyse.
V3 UCLA Miniscope gir brukerne fleksibilitet til å bestemme om de skal avbilde nevronaktivitet med et ett- eller tolinsesystem7. Valget av opptakssystem er basert på dybden og størrelsen på målhjerneområdet. Kort sagt, et objektivsystem kan bare avbilde et område som er overfladisk (mindre enn ca. 2,5 mm dypt) og relativt stort (større enn ca. 1,8 x 1,8 mm2) fordi produsentene bare produserer en viss størrelse objektivlinse. I motsetning til dette kan et to-linsesystem brukes på et hvilket som helst målhjerneområde. Imidlertid har tannsementen for liming av grunnplaten en tendens til å forårsake feiljustering med en endret avstand mellom objektiv- og relélinsene, noe som resulterer i dårlig bildekvalitet. Hvis tolinsesystemet brukes, må to arbeidsavstander målrettes nøyaktig for å oppnå optimal bildekvalitet (figur 1A). Disse to kritiske arbeidsavstandene er mellom nevronene og bunnen av relélinsen, og mellom den øverste overflaten av relélinsen og den nederste overflaten av objektivlinsen (figur 1A1). Enhver feiljustering eller feilplassering av objektivet utenfor arbeidsavstanden resulterer i bildefeil (figur 1C2). I motsetning til dette krever systemet med ett objektiv bare én presis arbeidsavstand. Imidlertid begrenser objektiv linsestørrelse dens anvendelse for overvåking av dype hjernegrupper (objektivlinsen som passer til miniskopet er ca. 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Derfor er implantasjon av en objektiv linse begrenset for observasjon av overflaten og relativt store hjernegrupper, som cortex 6,15 og dorsal cornu ammonis 1 (CA1) hos mus11,13 . I tillegg må et stort område av cortex aspireres for å målrette dorsale CA111,13. På grunn av begrensningen i en-linsekonfigurasjonen som forhindrer avbildning av dype hjerneregioner, tilbyr kommersielle miniskopsystemer bare en kombinert objektivlinse / relélinse (to-linse) design. På den annen side kan V3 UCLA-miniskopet modifiseres til enten et objektiv- eller tolinsesystem fordi objektivlinsen er flyttbar 6,11,13,15. Med andre ord kan V3 UCLA-miniskopbrukere dra nytte av den flyttbare linsen ved å implantere den i hjernen (lage et linsesystem), når de utfører eksperimenter som involverer overfladiske hjerneobservasjoner (mindre enn 2,5 mm i dybden), eller ved å forankres det i miniskopet og implantere en relélinse i hjernen (lage et to-linsesystem), når du utfører eksperimenter som involverer dype hjerneobservasjoner. To-linsesystemet kan også brukes til overfladisk observasjon av hjernen, men forskeren må vite de nøyaktige arbeidsavstandene mellom objektivlinsen og relélinsen. Den største fordelen med ettlinsesystemet er at det er en redusert sjanse for å savne arbeidsavstandene enn med et tolinsesystem, gitt at det er to arbeidsavstander som må målrettes nøyaktig for å oppnå optimal bildekvalitet i tolinsesystemet (figur 1A). Derfor anbefaler vi å bruke et linsesystem for overfladiske hjerneobservasjoner. Men hvis eksperimentet krever avbildning i det dype hjerneområdet, må forskeren lære å unngå feiljustering av de to linsene.
Den grunnleggende protokollen for to-linsekonfigurasjon av miniskoper for eksperimenter inkluderer linseimplantasjon og baseplettering 8,10,16,17. Baseplating er liming av en baseplate på et dyrs hode slik at miniskopet til slutt kan monteres på toppen av dyret og videobånd fluorescenssignalene til nevroner (figur 1B). Denne prosedyren innebærer å bruke tannsement til å lime baseplaten på skallen (figur 1C), men krymping av tannsement kan forårsake uakseptable endringer i avstanden mellom den implanterte relélinsen og objektivlinsen 8,17. Hvis den forskjøvede avstanden mellom de to linsene er for stor, kan ikke cellene bringes i fokus.
Detaljerte protokoller for dype hjernekalsiumavbildningseksperimenter ved hjelp av miniskoper er allerede publisert8,10,16,17. Forfatterne av disse protokollene har brukt Inscopix-systemet8,10,16 eller andre tilpassede design17 og har beskrevet de eksperimentelle prosedyrene for virusseleksjon, kirurgi og baseplatefeste. Protokollene deres kan imidlertid ikke brukes nøyaktig på andre open source-systemer, for eksempel V3 UCLA Miniscope-systemet, NINscope6og Finchscope19. Feiljustering av de to linsene kan oppstå under opptaket i en to-linsekonfigurasjon med et UCLA-miniskop på grunn av typen tannsement som brukes til å sementere grunnplaten til skallen8,17 (Figur 1C). Den nåværende protokollen er nødvendig fordi avstanden mellom den implanterte relélinsen og objektivlinsen er tilbøyelig til å skifte på grunn av uønsket krymping av tannsement under basepletteringsprosedyren. Under baseplettering må den optimale arbeidsavstanden mellom den implanterte relélinsen og objektivlinsen finnes ved å justere avstanden mellom miniskopet og toppen av relélinsen, og baseplaten skal deretter limes på dette ideelle stedet. Etter at riktig avstand mellom objektivlinsen og den implanterte relélinsen er angitt, kan langsgående målinger oppnås ved cellulær oppløsning (Figur 1B; in vivo innspilling). Siden det optimale spekteret av arbeidsavstander for et reléobjektiv er lite (50 – 350 μm)4,8, kan overdreven sementkrymping under herding gjøre det vanskelig å holde objektivlinsen og den implanterte relélinsen innenfor riktig område. Det overordnede målet med denne rapporten er å gi en protokoll for å redusere krympeproblemene8,17 som oppstår under basepletteringsprosedyren og for å øke suksessraten for miniskopopptak av fluorescenssignaler i en tolinsekonfigurasjon. Vellykket miniskopopptak er definert som opptak av en livestream av merkbare relative endringer i fluorescensen til individuelle nevroner i et fritt oppførende dyr. Selv om forskjellige merker av dental sement har forskjellige krympehastigheter, kan forskere velge et merke som tidligere er testet6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Imidlertid er ikke alle merker enkle å få tak i i enkelte land/regioner på grunn av importforskriftene for medisinsk materiale. Derfor har vi utviklet metoder for å teste krympehastigheten til tilgjengelige tannsement og, viktigere, gi en alternativ protokoll som minimerer krympeproblemet. Fordelen i forhold til den nåværende basepletteringsprotokollen er en økning i suksessraten for kalsiumavbildning med verktøy og sement som lett kan oppnås i laboratorier. UCLA-miniskopet brukes som et eksempel, men protokollen gjelder også for andre miniskoper. I denne rapporten beskriver vi en optimalisert grunnpletteringsprosedyre og anbefaler også noen strategier for montering av UCLA-miniskopets tolinsesystem (Figur 2A). Både eksempler på vellykket implantasjon (n = 3 mus) og eksempler på mislykket implantasjon (n = 2 mus) for tolinsekonfigurasjonen med UCLA-miniskopet presenteres sammen med diskusjonene på grunn av suksessene og fiaskoene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapporten beskriver en detaljert eksperimentell protokoll for forskere som bruker to-linse UCLA Miniscope-systemet. Verktøyene designet i protokollen vår er relativt rimelige for ethvert laboratorium som ønsker å prøve in vivo kalsiumavbildning. Noen protokoller, for eksempel viral injeksjon, linseimplantasjon, dummy baseplating og baseplating, kan også brukes til andre versjoner av miniskopsystemet for å forbedre suksessraten for kalsiumavbildning. Annet enn generelle problemer med viral injeksjon …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
Riferimenti
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
- Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
- Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
- Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
- Hart, E. E., Blair, G. J., O’Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
- Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).
