Summary
نحن نقدم بروتوكولا لقياس الاستجابة الدوائية والإشعاعية في الوقت الحقيقي لخلايا الدماغ النقيلية لسرطان الثدي في نموذج شريحة الدماغ العضوية النمطية. توفر الطرق فحصا كميا للتحقيق في الآثار العلاجية للعلاجات المختلفة على نقائل الدماغ من سرطان الثدي بطريقة خارج الجسم الحي داخل واجهة البيئة الدقيقة للدماغ.
Abstract
ورم خبيث في الدماغ هو نتيجة خطيرة لسرطان الثدي للنساء حيث يصعب علاج هذه الأورام وترتبط بنتائج سريرية سيئة. نماذج الفئران قبل السريرية لسرطان الثدي نمو الدماغ النقيلي (BCBM) مفيدة ولكنها باهظة الثمن ، ومن الصعب تتبع الخلايا الحية وغزو الخلايا السرطانية داخل حمة الدماغ. يظهر هنا بروتوكول لمزارع شرائح الدماغ خارج الجسم الحي من الفئران المطعمة بالأجانب التي تحتوي على خطوط فرعية نسلية لسرطان الثدي عن طريق الحقن داخل الجمجمة. تم حقن الخلايا الموسومة ب MDA-MB-231BR luciferase داخل الجمجمة في أدمغة الفئران الإناث Nu / Nu ، وبعد تكوين الورم ، تم عزل الأدمغة وتقطيعها وزراعتها خارج الجسم الحي. تم تصوير شرائح الورم لتحديد الخلايا السرطانية التي تعبر عن luciferase ومراقبة انتشارها وغزوها في حمة الدماغ لمدة تصل إلى 10 أيام. علاوة على ذلك ، يصف البروتوكول استخدام المجهر بفاصل زمني لتصوير النمو والسلوك الغازي للخلايا السرطانية بعد العلاج بالإشعاع المؤين أو العلاج الكيميائي. يمكن تصور استجابة الخلايا السرطانية للعلاجات عن طريق التصوير المجهري الحي ، وقياس شدة التلألؤ الحيوي ، وإجراء علم الأنسجة على شريحة الدماغ التي تحتوي على خلايا BCBM. وبالتالي ، قد يكون نموذج شريحة خارج الجسم الحي هذا منصة مفيدة للاختبار السريع للعوامل العلاجية الجديدة بمفردها أو بالاشتراك مع الإشعاع لتحديد الأدوية المخصصة لاستهداف نمو الدماغ النقيلي لسرطان الثدي لدى المريض داخل البيئة الدقيقة للدماغ.
Introduction
تتطور نقائل الدماغ لسرطان الثدي (BCBM) عندما تنتشر الخلايا من ورم الثدي الأساسي إلى الدماغ. سرطان الثدي هو السبب الثاني الأكثر شيوعا لانبثاث الدماغ بعد سرطان الرئة ، مع حدوث النقائل في 10-16 ٪ من المرضى1. لسوء الحظ ، تظل النقائل الدماغية غير قابلة للشفاء حيث يموت >80٪ من المرضى في غضون عام بعد تشخيص ورم خبيث في الدماغ ، وتضعف نوعية حياتهم بسبب الاختلالات العصبية2. هناك حاجة ملحة لتحديد خيارات علاج أكثر فعالية. نماذج الثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد هي الطرق الأكثر استخداما في اختبار العوامل العلاجية في المختبر. ومع ذلك ، فإنها لا تحاكي البيئة الدقيقة BCBM المعقدة ، وهي محرك رئيسي للنمط الظاهري للورم ونموه. على الرغم من أن هذه النماذج مفيدة ، إلا أنها لا تلتقط التفاعلات المعقدة بين الورم واللحمية ، ومتطلبات التمثيل الغذائي الفريدة ، وعدم تجانس الأورام3. لتلخيص التفاعلات بين الورم واللحمية وعدم تجانس البيئة الدقيقة بشكل أكثر إخلاصا ، بدأت مجموعتنا وغيرها في توليد ثقافات "شرائح" خبيثة في الدماغ العضوي مع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض (الأولية أو النقيلية) أو خطوط الخلايا السرطانية4،5،6. بالمقارنة مع الأنظمة المختبرية الكلاسيكية ، قد يوفر هذا النموذج خارج الجسم الحي قصير الأجل ظروفا أكثر ملاءمة لفحص العلاجات الجديدة قبل التقييم قبل السريري في مجموعات الحيوانات الكبيرة.
تم بناء نماذج خارج الجسم الحي واستخدامها بنجاح في المقام الأول لتحديد العلاجات الناجحة لمختلف أنواع السرطان. وهي تتطلب بضعة أيام من التقييم ويمكن بالإضافة إلى ذلك أن تكون مصممة خصيصا لفحص الأدوية الخاصة بالمريض. على سبيل المثال ، أظهرت أنسجة المثانة وسرطان البروستاتا البشري خارج الجسم الحي استجابة مضادة للورم تعتمد على الجرعة من دوسيتاكسيل وجيمسيتابين7. تم تطوير سرطان القولون والمستقيم المماثل خارج أنسجة الجسم الحي لفحص أدوية العلاج الكيميائي Oxaliplatin و Cetuximab و Pembrolizumab8. وقد استخدم هذا التطبيق على نطاق واسع في سرطان البنكرياس، مع الأخذ في الاعتبار التفاعل الأساسي بين البيئة اللحمية والخصائص الجينية والنمط الظاهري للسرطان الغدي الأقنوي البنكرياس 9,10. علاوة على ذلك ، تم تطوير مثل هذه النماذج العضوية لإجراء فحوصات مماثلة في أورام الرأس والرقبة والمعدة والثدي11,12.
هنا ، يتم إنشاء نموذج شريحة دماغية خارج الجسم الحي من الخلايا السرطانية النقيلية لسرطان الثدي في بيئتها الدقيقة. تم حقن الفئران داخل الجمجمة مع سرطان الثدي الدماغ النقيلي الدماغ التغذية MDA-MB-231BR الخلايا13 في الفص الجداري القشرة الدماغية - وهو موقع شائع من TNBC ورم خبيث14,15 وسمح لتطوير الأورام. تم توليد شرائح الدماغ من هذه الحيوانات المطعمة بالأجانب وحافظت عليها خارج الجسم الحي كثقافات عضوية كما هو موضحفي 16,17. يسمح هذا النموذج الجديد خارج الجسم الحي بتحليل نمو خلية BCBM داخل حمة الدماغ ويمكن استخدامه لاختبار العوامل العلاجية والتأثيرات الإشعاعية على الخلايا السرطانية داخل البيئة الدقيقة للدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول ويتبع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة دريكسل (IACUC). تم استخدام الفئران الإناث Nu / Nu athymic (6-8 أسابيع) في هذه الدراسة.
1. الحقن داخل الجمجمة للخلايا السرطانية
- تعقيم جميع المعدات (ملاقط ، مقص ، مقص خياطة ، مثقاب يدوي) تحت دورة جافة من الأوتوكلاف لمدة تصل إلى 45 دقيقة في أكياس التعقيم ، بما في ذلك مؤشر التعقيم. في حالة إجراء عمليات جراحية على متعددة ، قم بتعقيم الأدوات بين الحيوانات باستخدام معقم خرز ساخن (حتى 3x).
- تخدير الفئران وفقا لبروتوكول رعاية الحيوانات للمستخدمين (على سبيل المثال ، الأيزوفلوران (4 ٪ للحث ، 1-2 ٪ الصيانة) وإدارة التسكين (تحت الجلد ، 0.1 مل من 0.1mg / kg buprenorphine SR-LAB) قبل بدء الجراحة. ضمان عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم.
- ضع الفئران في إطار مجسمة وشل حركة الرأس باستخدام قضبان الأذن القياسية (الشكل 1A). تطبيق مرهم العيون على العينين.
- تعقيم سطح الرأس عن طريق التطبيق المتكرر بالتناوب (3x) من مسحات اليود و 70٪ من الإيثانول قبل الشق.
- استخدم مشرطا جراحيا لإجراء شق خط الوسط 1 سم عبر الجلد بزاوية قطرية قليلا إلى الخط الوهمي الذي يقسم دماغ الفئران إلى نصفين متماثلين لفضح الجمجمة. امسح أي دم بقطعة قطن.
- قم بتحويل الجلد أفقيا لفضح موقع الحقن: 2 مم على اليمين ، 1 مم إلى الأمام مع الإشارة إلى البريجما (+2 متوسط الجانب) ، +1 السطح / الذيلي (+1RC).
- استخدم بت بير (0.73 مم) لاختراق الجمجمة +2ML ، +1RC إلى bregma وحفر ثقب باستخدام ضغط طفيف وحركة التواء.
- استخدم حقنة حقن الدماغ لحقن 5 ميكرولتر من 100000 خلية MDA-MB-231BR (تعبر بثبات عن GFP-Luciferase) / محلول ميكرولتر في محلول 1x PBS معقم عن طريق إدخال المحقنة في البداية بعمق 3.5 مم إلى الدماغ.
- اترك المحقنة تستقر لمدة 2 دقيقة. اسحبه لأعلى حوالي 1 مم ، وبعد 2 دقيقة ، قم بحقن النصف الأول من الحجم ببطء.
- انتظر لمدة 2 دقيقة أخرى قبل حقن الباقي ، ثم اسحب المحقنة ببطء بعد 3 دقائق من الحقن النهائي.
ملاحظة: الحقن البطيء تجريبي في السماح لأنسجة المخ بامتصاص الحجم جيدا وعدم خلق تسرب بعد سحب المحقنة ، مما قد يؤدي إلى نمو الخلايا السرطانية خارج الموقع المقصود. - ضع شمع العظام على موقع الحقن على الجمجمة ثم استخدم خيوط البولي بروبيلين لخياطة الأنسجة. سوف تتعافى الفئران في غضون 5 دقائق بعد إزالة التخدير.
- راقب سلوكهم مباشرة بعد الجراحة لمدة 10 دقائق و 3 ساعات في وقت لاحق وفي اليوم التالي لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى علاج خاص ، بما في ذلك الحقن الملحي والأغذية اللينة وما إلى ذلك ، للمساعدة في الشفاء السريع.
- راقب نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي على نظام التصوير.
- لهذا ، أولا ، قم بتشغيل الأكسجين والأيزوفلوران على نظام التصوير. اسمح بتوزيع كليهما على الغرفة المنفصلة خارج صندوق التصوير.
- ثم قم بتشغيل البرنامج وتهيئة الأداة واختر الخيار المناسب لتصور جسم الماوس بالكامل والتقاطه.
- ضع الفئران في الغرفة المنفصلة مع الأيزوفلوران وتأكد من عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم. حقن الفئران داخل الصفاق مع 200 ميكرولتر من 30 ملغ / مل لوسيفيرين.
- انقل معدة الفئران إلى أنف غرفة التصوير المزود بالأكسجين والأيزوفلوران. قفل الغرفة ، واختيار التعرض 2 دقيقة لبدء التصوير.
- استخدم أداة ROI (منطقة الاهتمام) الخاصة بالبرنامج لتحديد كمية إشارة اللمعان الحيوي للورم.
- لتحليل حجم الورم ، اختر أداة شكل الدائرة ، وتناسبها حول شكل الورم وحجمه. قياس عائد الاستثمار والإبلاغ عن إجمالي القراءات.
- اسمح بنمو الورم الصلب لمدة 12-14 يوما (أو حتى يصل لوسيفيراز إلى حوالي 7.0 × 106 وحدات) (الشكل 1 ب) قبل توليد شرائح الدماغ.
ملاحظة: زيادة عدد الخلايا المراد حقنها سيؤدي إلى نمو الورم بشكل أسرع. لذلك ، يمكن أن يحدث توليد شرائح الدماغ قبل 12 يوما. من ناحية أخرى ، سيؤدي الورم الأكبر إلى المزيد من شرائح GFP + إذا سمح لها بالنمو لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما ، تبدأ صحة الفئران في التدهور بسرعة ؛ وبالتالي يجب زيادة مراقبة صحة الحيوان إلى مرة واحدة يوميا بعد النقطة الزمنية البالغة 10 أيام ، ويجب استخدام أي فئران تظهر عليها علامات الألم و / أو عدم الراحة لتوليد الشرائح.
2. توليد شرائح الدماغ
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات بعد عزل الدماغ في غطاء تدفق صفحي معقم. من الممكن عادة توليد 35-40 شريحة فردية تحتوي على خلايا سرطانية (إشارة luciferase) من فأر واحد يتم حقنه بخلايا MDA-MB-231BR (الشكل 1C).
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف. ضع قطاعة الأنسجة في غطاء التدفق الرقائقي المعقم ونظف جميع الأدوات والأدوات باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪.
- بعد 12-14 يوما من حقن خلايا MDA-MB-231BR داخل الجمجمة ، قم بتخدير الفئران وفقا لبروتوكول رعاية الحيوانات للمستخدمين كما هو موضح في 1.2. ضمان عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم.
- إزالة ووضع أدمغتهم بسرعة (في غضون 45 ثانية) في الثلج البارد (4 درجة مئوية) السكروز-ACSF تتكون مما يلي: 280 mM السكروز ، 5 mM KCl ، 2 mM MgCl 2 ، 1 mM CaCl 2 ، 20 mM الجلوكوز ، 10 mM HEPES ، 5 mM Na + - الأسكوربات ، 3 mM thiouria ،2 mM Na + ، 29 mM pyruvate ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3.
- باستخدام مشرط حاد ومعقم أو شفرة حلاقة، قم بقطع الأجزاء الزائدة من الدماغ التي لا تحتوي على أي ورم من جميع الجوانب، بما في ذلك الجزء السفلي من الدماغ.
- أحضر شكل الدماغ إلى مكعب غير مثالي للجلوس بشكل مسطح على ورق الترشيح المبلل ACSF على غطاء طبق 60 مم لتسهيل التقطيع.
ملاحظة: تتم إزالة الأنسجة الإضافية للدماغ حيث من غير المحتمل أن يكون الورم قد نما قبل التقطيع للسماح بتوليد شرائح GFP + في الغالب وإنشاء شكل من أشكال الدماغ مستقر على سطح الأداة ولن ينزعج من الاهتزازات الناجمة عن التقطيع. - ضع عدة أوراق من دوائر ورق الترشيح المبللة مسبقا (مع ACSF) على منصة القطع وضع الأنسجة المسدودة فوقها.
- اضبط حجم القطع على الأداة على 2 أو 2.5 وحدة على المسطرة المتوفرة لتقطيع الأنسجة إلى أقسام 200-250 ميكرومتر.
ملاحظة: الشرائح التي يصل حجمها إلى 350 ميكرومتر أو التي يصل سمكها إلى 100 ميكرومتر قابلة للحياة. بالنسبة للشرائح <200 ميكرومتر ، استخدم اهتزازا أو ضغطا. - استخدم فرشاة الطلاء (السمور) لنقل شرائح الدماغ إلى طبق يحتوي على السكروز ACSF وفصل الشرائح تحت المجهر الضوئي باستخدام إبر 27 G.
- حدد شرائح GFP الإيجابية تحت المجهر الفلوري وانقلها إلى طبق جديد 60 مم يحتوي على 2-3 مل من وسائط الشرائح البالغة (Neurobasal medium A ، 2٪ B12 supplement ، 1٪ N2 supplement ، 1٪ glutamine ، 0.5٪ glucose ، 10 U / ml penicillin ، و 100 μg / mL streptomycin) باستخدام ماصة معقمة 1 مل مقطوعة (فتحة واسعة).
ملاحظة: يتم استبعاد شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا سرطانية تنمو على سطح الدماغ (ربما بسبب تسرب خلايا الحقن ، وما إلى ذلك). - انقل 3-5 شرائح على كل 30 مم ، 0.4 ميكرومتر حجم المسام مزرعة الأنسجة إدراج في لوحات 6 آبار على مسافة لا تسمح بالنمو في بعضها البعض.
- قم بإزالة الوسط الزائد من سطح الإدراج باستخدام ماصة P1000 ، وأضف 1 مل من وسط شريحة الماوس البالغ أسفل كل إدراج وقم بموازنة الوسائط في الحاضنة قبل التقطيع.
- احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، ورطوبة 95٪ لمدة 24 ساعة قبل التصوير.
3. تصوير IVIS للشرائح
ملاحظة: قم بإجراء خطوات إضافة اللوسيفيراز والمثبطات في غطاء التدفق الرقائقي المعقم.
- ماصة 5 ميكرولتر من محلول لوسيفيرين 30 ملغم / مل في الوسط تحت الإدخالات عن طريق رفع الإدراج بالملقط ووضعه مرة أخرى في البئر بعد إضافة لوسيفيرين إلى الوسائط الموجودة في البئر.
- ضع اللوحة المكونة من 6 آبار مع الغطاء داخل غرفة التصوير الخاصة بالأداة أسفل الكاميرا الثابتة وقم بقفل باب الغرفة.
- افتح البرنامج وقم بتهيئة الأداة.
- اختر إعدادات الكاميرا التي تسمح بالتصور والتقاط بئر واحد فقط لكل صورة. حرك المرحلة لأعلى (FOV من 5 سم) ووضع البئر الذي يجب تصويره مباشرة تحت الكاميرا.
- اضبط وقت التصوير على الأنسب اعتمادا على شدة اللوسيفيراز التي سينبعث منها الورم ، والتي يمكن أن تختلف من 10 ثوان إلى 5 دقائق. ابدأ بضبطها على 10 ثوان ثم قم بزيادتها إذا كانت الإشارة منخفضة ولكن احتفظ بها متسقة لجميع النقاط والظروف الزمنية حتى نهاية التجربة (الشكل 1D).
- استخدم أداة عائد الاستثمار (أداة شكل الدائرة) ، وقم بملاءمتها حول شكل الورم وحجمه ، وقم بقياس عائد الاستثمار ، وأبلغ عن إجمالي القراءات لتحديد إشارة اللمعان الحيوي لكل ورم على الشريحة.
- أعد اللوحة إلى غطاء التدفق الرقائقي المعقم ، واستخدم الملقط لرفع الإدراج قليلا من البئر.
- استنشق الوسط واستبدله ب 1 مل من الوسط الطازج وضع الإدراج مرة أخرى في البئر.
- بالنسبة للتجارب التي يتم فيها معالجة الشرائح بمركبات مختلفة مثل المثبطات والأيضات وما إلى ذلك ، قم بإعداد التركيز المناسب للكاشف في 1.2 مل من وسائط شرائح الدماغ في أنبوب 1.5 مل ثم انقل 1 مل إلى البئر الذي يحتوي على الشريحة.
- كرر هذه العملية كل 48 ساعة طوال مدة الدراسة.
4. التصوير الحي لنمو الورم في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي
ملاحظة: إمداد الإدخالات بمتوسط كاف (1.5 مل) لتحمل طول التجربة حيث لا يمكن إضافة وسيط إضافي أثناء التصوير المباشر.
- ضع اللوحة المكونة من 6 آبار على حامل لوحة المجهر الآلي داخل الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، ورطوبة 95٪).
- افتح البرنامج، وقم بتشغيل brightfield على الربع الأول لضبط التعرض اللازم لعرض الشرائح. للعثور على موضع (إحداثيات "xy") للشريحة ، انتقل باستخدام "xy" على الربع الثاني للتحكم في إحداثيات "xyz" للمجهر.
- حدد لوحة 6-well كأدوات مختبرية مستخدمة لهذه التجربة. حدد محرر خرائط عائد الاستثمار وسجل هذا الموضع عن طريق تحديد عائد استثمار جديد، وإضافة عائد استثمار هذا وحفظه.
- كرر نفس الخطوات لجميع المناطق الأخرى ذات الأهمية في الآبار الأخرى. بعد إضافة جميع عائد الاستثمار، احفظ جميع عائد الاستثمار.
- ضمن البروتوكول، حدد مسح موجود وحدد الفاصل الزمني ضمن الاستحواذ، متبوعا بتحديد قنوات الاهتمام (في هذه الحالة GFP).
- أوقف التركيز البؤري التلقائي في إعداد التركيز البؤري واضبط التركيز البؤري المناسب لجميع الشرائح يدويا. أخيرا ، اضبط كثافة Brightfield وإثارة قناة الفلورسنت ووقت التعرض إلى المستوى المناسب.
- اضبط البروتوكول للحصول على صور كل 15 دقيقة لمدة 48 ساعة.
- حفظ البروتوكول وتشغيله. في نهاية التجربة ، سيحتوي الملف المحفوظ على كل من صور brightfield و GFP التي تم التقاطها لكل عائد استثمار.
- لدمج الصور في مقطع فيديو، أعد تسمية جميع الصور ذات الأهمية بنفس الاسم متبوعة برقم ثنائي لتنظيمها بالترتيب الذي تم التقاطها به (على سبيل المثال، ROI1 (1)، RO1 (2) ...)
- افتح ImageJ واستورد الصور بالنقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور. حدد أسماء الملفات التي تظهر في قائمة، واكتب محتوى اسم الملفات في المربع يحتوي على اسم الملف الذي سيظهر لتحديد تلك الملفات المحددة للفيديو.
- احفظ الصور المدمجة ضمن ملف > حفظ باسم > AVI.
5. فحص MTS والكيمياء النسيجية المناعية لأنسجة المخ خارج الجسم الحي
- فحص MTS
- قم باستئصال الشرائح عن طريق قطع غشاء زراعة الأنسجة أسفل كل شريحة على طول حواف الأنسجة ونقل الأنسجة ، التي لا تزال متصلة بالغشاء ، إلى صفيحة من 96 بئرا.
- أضف كاشف MTS الممزوج بنسبة 1:5 مع وسائط الثقافة و 0.01٪ triton (1x) للسماح باختراق المحلول في الأنسجة ، بحجم إجمالي قدره 120 ميكرولتر في كل بئر.
- استخدم 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) كعامل لجعل شرائح الدماغ غير قابلة للحياة ، وبالتالي تحكم إيجابي لهذه التجربة. اغمر شريحة الدماغ ذات الأهمية في 4٪ PFA لمدة 1 ساعة في RT (درجة حرارة الغرفة) أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية قبل المتابعة في فحص MTS.
- اسمح لكاشف MTS بالتفاعل على الشرائح لمدة 4 ساعات ، وقم بإزالة الشرائح من الآبار وقياس الامتصاص عند 490 نانومتر لجميع الظروف ، بما في ذلك بئر فارغ بدون شريحة كمرجع.
- الإبلاغ عن القراءات كدالة لمنطقة شريحة الأنسجة، التي تم قياسها باستخدام مسطرة الفرجار الرقمية.
- إعداد الكيمياء النسيجية المناعية
- اغمر شرائح الدماغ المتصلة بسطح الغشاء في 10٪ من الفورمالين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- قم بإجراء التضمين والمعالجة والحجب وتوليد شرائح غير ملطخة من الأنسجة. استخدم بروتوكول تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية القياسي لتلطيخ H & E و Ki-67 و gamma-H2AX و CC3 و GFAP و GFP و DAPI
6. تشعيع الورم في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي
- تشعيع الورم مع 6 Gy (310 كيلو فولت من الأشعة السينية).
ملاحظة: الوحدات التي تم إدخالها للحصول على الجرعة الإجمالية من 6 Gy هي 3522 وحدة بعد النظر في وحدات R (تم قياسها باستخدام مقياس فيكتورين الكهربائي) وتصحيحات ل thimble وكثافة الهواء و cGy / R كما هو موضح سابقا18. وقت التعرض هو 130.9 ثانية. - استخدم 0.25 مم Cu + 1 مم Al Add filtration ، 50 سم SSD ، 125 cGy في الدقيقة.
- قم بإجراء قياس الجرعات بواسطة غرفة تأين داخل الحزمة معايرة وفقا لمعيار أساسي.
- قم بإجراء تصحيحات يومية للرطوبة ودرجة الحرارة والضغط الجوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم حقن خلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase داخل الجمجمة في نصف الكرة الأيمن لفئران Nu / Nu البالغة من العمر 4-6 أسابيع كما هو موضح أعلاه (الشكل 1A) وسمح لها بالنمو لمدة 12-14 يوما ، وخلال هذه الفترة تم رصد نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي (الشكل 1B). لقد حقن 100,000 خلية سرطانية داخل الجمجمة كما ذكرت المجموعات الأخرى19 ، ولكن من الممكن حقن ما يصل إلى 20,000 خلية20. بعد توليد شرائح الدماغ (الشكل 1C) ، كما هو موضح أعلاه ، تم تصوير الشرائح على IVIS لتحديد وجود الورم عن طريق التصوير الحيوي بعد 24 ساعة من الحضانة. يعتبر هذا اليوم 0. تم رصد نمو الورم عن طريق تحديد إشارات الإنارة الحيوية كل 48 ساعة ، مما يشير إلى النمو التدريجي على مدى 6 أيام (الشكل 1D). يؤكد تلطيخ H&E والتألق الإيجابي GFP وجود ورم في شريحة الدماغ (الشكل 1D). تمكنا أيضا من اكتشاف تلطيخ الخلايا النجمية التفاعلية ، التي تم تصورها عن طريق تلطيخ الخلايا الإيجابية للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، المرئية بين مجموعة الخلايا السرطانية (GFP-positive) (الشكل 1D) على غرار ما شوهد في الجسم الحي21. على عكس النماذج التي تقوم بتلقيح الخلايا السرطانية خارج الجسم الحي في شريحة دماغ الفأر22 ، يحتوي هذا النموذج على خلايا نجمية تفاعلية تعد جانبا مهما من البيئة الدقيقة لورم BCBM. كما نكتشف زيادة تلطيخ Ki-67 مما يؤكد أن الخلايا السرطانية شديدة التكاثر (الشكل 1D). وبالتالي ، يمكن للخلايا السرطانية داخل حمة الدماغ البقاء على قيد الحياة والتكاثر داخل شريحة الدماغ خارج الجسم الحي لعدة أيام وتحتوي أيضا على السدى المرتبطة بالورم.
التشعيع (IR) هو واحد من الخطوط الأولى للعلاج للمرضى الذين يعانون من نقائل الدماغ في العيادة. لفهم كيفية استجابة نموذج شريحة الجسم الحي السابق لمثل هذا العلاج ، تعرضت شرائح الدماغ التي تحتوي على أورام MDA-MB-231BR-GFP Luciferase للإشعاع 6Gy. واستمرت الأورام في شرائح الدماغ التي لم تتعرض للتشعيع في النمو خارج الجسم الحي، في حين أظهرت الأورام المعرضة للتشعيع نموا متوقفا (الشكل 2 ألف). كما تمت مراقبة شرائح الدماغ التي تحتوي على أورام MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase عن طريق التصوير الحي لمدة 48 ساعة بعد اليوم 4 لتصور نمو الورم في البيئة الدقيقة للدماغ بعد علاج الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2B). تمشيا مع التصوير الحيوي ، ينظر إلى خلايا سرطان التحكم تنمو بسرعة مع زيادة كثافة GFP وينظر إلى عدد من الخلايا تغزو حمة الدماغ (فيديو 1). في المقابل ، فإن الخلايا السرطانية في شرائح الدماغ المعالجة ب 6Gy IR هي الخلايا الخلوية ، ويتم الحفاظ على كثافة GFP (فيديو 2). يؤكد تلطيخ H & E الأورام الأصغر في الخلايا المعالجة بالأشعة تحت الحمراء (الشكل 2C). اكتشفنا أيضا خلايا سرطانية كبيرة متعددة النوى وزيادة في تلطيخ علامة تلف الحمض النووي g-H2AX في الخلايا السرطانية المعالجة بالأشعة تحت الحمراء (الشكل 2C). لم يتم الكشف عن أي زيادة في موت الخلايا المبرمج في الشرائح المعالجة بالأشعة تحت الحمراء ، مما يشير إلى أن الأشعة تحت الحمراء قد تقلل من الانتشار (الشكل 2C). ومع ذلك ، تم الكشف عن زيادة في تلطيخ الخلايا النجمية التفاعلية ، والتي تم تصورها عن طريق تلطيخ الخلايا الإيجابية GFAP ، والتي تكون مرئية حول مجموعة الخلايا السرطانية (GFP-positive) التي يعالجها الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2C). هذا يشير إلى أن هذا النموذج خارج الجسم الحي قد يكون مفيدا أيضا في فهم كيفية استجابة بعض مكونات الورم السدى للعلاجات. بالإضافة إلى ذلك ، لم نكتشف أي موت الخلايا المبرمج الناجم عن العلاج بالأشعة تحت الحمراء لشرائح فئران الدماغ الخالية من الورم (الشكل 2D).
اختبرنا أيضا ما إذا كانت أورام MDA-MB-231BR سابقة التشكيل في شرائح الدماغ ستستجيب للعلاج الكيميائي. تم التعامل مع شرائح الدماغ التي تحتوي على أورام MDA-MB-231BR بتركيزات مختلفة من باكليتاكسيل (الشكل 3A) ، وهو دواء علاجي كيميائي يستخدم في مرضى سرطان الثدي23. قلل العلاج من حجم الورم كما تم تحديده كميا بواسطة إشارات الإنارة الحيوية ، لكن هذا التثبيط كان كبيرا فقط بعد اليوم 10 من العلاج (الشكل 3A). قد يكون هذا بسبب استجابة غير متجانسة للباكليتاكسيل خارج الجسم الحي. على سبيل المثال ، في 40 نانومتر تعامل بشكل جيد ، يتم تقليل شريحة واحدة تحتوي على ورم (أعلى) بينما يبدو أن الورم (أسفل) في نفس البئر ينمو. أيضا ، بدا أن بعض الأورام الأصغر حجما أكثر حساسية للباكليتاكسيل وأظهرت انخفاضا في التلألؤ الحيوي ، في حين بدت الأورام الأكبر مقاومة للحرارة (الشكل 3A ، علاج 80 نانومتر). واتساقا مع انخفاض حجم الورم، تم الكشف عن زيادة في موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية المعالجة بالباكليتاكسيل مقارنة بالضوابط (الشكل 3B). الأهم من ذلك ، باستخدام اختبار MTS الجدوى كما تم تكييفه من Mews et al. لدمج استخدام triton24 ، اختبرنا أن العلاج المثبط لم يغير من صلاحية أنسجة المخ (في حالة عدم وجود ورم) (الشكل 3C). وتماشيا مع هذه النتيجة، لم نكتشف ونزيد موت الخلايا المبرمج كما تم قياسه بواسطة تلطيخ كاسباز 3 المشقوق في شريحة دماغ الفأر الخالية من الورم المعالجة بالباكليتاكسيل (الشكل 3D). تشير هذه البيانات إلى أن هذا النموذج قد يكون مفيدا في فهم استجابة العلاج الكيميائي ومقاومة BCBM داخل بيئة دقيقة في الدماغ. نظرا لطبيعة النموذج ، وهو إعداد خارج الجسم الحي يحافظ على خصائص وتفاعل ورم الدماغ ، فإن جوهريته تقف في تقديم دليل أولي على استجابة BCBM لكواشف العلاج الكيميائي وبالتالي القضاء على الأدوية التي لا تقلص الورم في هذا النموذج من التجارب المستقبلية في الجسم الحي ، والتي لا تزال ضرورية في التحقق من صحة تأثير الأدوية التي توفر نتائج إيجابية في هذا النموذج ، الاستجابة النظامية في الكائن الحي ، والقدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ.
الشكل 1. الحقن داخل الجمجمة ، وتوليد شريحة الدماغ ، ونمو BCBM خارج الجسم الحي. (أ) التمثيل التخطيطي للفأر أثناء الحقن داخل الجمجمة تحت أداة مجسمة. (ب) صور تمثيلية للكشف عن الإنارة الحيوية للأورام من فئران Nu/Nu عمرها 4-6 أسابيع تم حقنها بخلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase البالغة من العمر 4-6 أسابيع بعد 12 يوما من الحقن. (ج) التمثيل التخطيطي لتوليد شرائح دماغ الفئران خارج الجسم الحي من (ب). (د) صور تمثيلية تصور نمو الورم في شرائح الدماغ ذات النمط العضوي المشتقة من الفئران التي تم حقنها داخل الجمجمة بخلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase المكتشفة عن طريق التلألؤ الحيوي على مدى 6 أيام. H & E & Ki-67 ، GFP (الخلايا السرطانية) GFAP (الخلايا النجمية التفاعلية) DAPI (النواة) تلطيخ شريحة دماغية تمثيلية مع الورم (تكبير الصورة 20x ، شريط المقياس: 200 ميكرومتر). يمثل القياس الكمي لنمو الورم إشارة التلألؤ الحيوي بالنسبة لليوم 0 (n = 3). تم الإبلاغ عن اختبار t للطالب كمتوسط ± SEM ، * p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. علاج شرائح الدماغ العضوية BCBM بالإشعاع. (أ) صور تمثيلية تصور نمو الورم في شرائح الدماغ ذات النمط العضوي المشتقة من الفئران التي تم حقنها داخل الجمجمة بخلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase المكتشفة عن طريق التلألؤ الحيوي. لا تتعرض الأورام لأي تشعيع أو تشعيع 6 Gy (جرعة واحدة) ويسمح لها بالنمو في الأيام المشار إليها. القياس الكمي لنمو الورم في اليوم المحدد (السيطرة. n = 3 ؛ 6Gy ، n = 3). تم الإبلاغ عن اختبار t للطالب كمتوسط ± SEM. * p < 0.05. (ب) تم تصوير شرائح الدماغ لمدة 48 ساعة كل 15 دقيقة. تشير الصور التمثيلية لمقاطع الفيديو الخاصة بالعينات غير المشععة والمشععة إلى نمو الورم. (ج) تم تثبيت الشرائح، كما تمت معالجتها في (A)، وفحصها ل H&E و g-H2AX و DAPI و Cleaved-Caspase-3 (CC3) وتلطيخ GFP (تكبير الصورة 20x، شريط المقياس: 200 ميكرومتر). (د) عوملت شرائح دماغ الفأر الخالية من الورم كما في (أ) وتم إصلاحها وفحصها ل CC3 و DAPI (تكبير الصورة 20x ، شريط المقياس: 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. علاج شرائح الدماغ العضوية BCBM مع باكليتاكسيل. (أ) شرائح الدماغ المشتقة من الفئران التي يتم حقنها داخل الجمجمة بخلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase المعالجة ب DMSO أو بعد علاج باكليتاكسيل عند 40 نانومتر و 80 نانومتر و 160 نانومتر و 320 نانومتر لمدة 10 أيام ، مع تجديد الوسط كل 48 ساعة والسماح له بالنمو للأيام المشار إليها (تكبير الصورة 20x ، شريط المقياس: 200 ميكرومتر). تحديد كمية نمو الورم في اليوم المحدد (التحكم n = 6 ، Paclitaxel n = 3) (أسفل). تم الإبلاغ عن اختبار t للطالب كمتوسط ± SEM. * p < 0.05. (ب) تم جمع شريحة الدماغ خارج الجسم الحي كما تمت معالجتها في (أ) إما باستخدام DMSO أو 320 نانومتر باكليتاكسيل وتثبيتها وفحصها ل GFP و CC3 و DAPI (تكبير الصورة 20x ، شريط المقياس: 200 ميكرومتر). (ج) تم جمع شريحة الدماغ خارج الجسم الحي كما عولجت في (أ) (بدون ورم) إما مع DMSO أو 320 نانومتر باكليتاكسيل في اليوم 10 وتحليلها من أجل بقاء الخلية (فحص MTS). كعنصر تحكم إيجابي ، تم التعامل مع الشرائح باستخدام بارافورمالديهايد (PFA) مما يجعل شرائح الدماغ غير قابلة للحياة (n = 3) تم الإبلاغ عن اختبار t للطالب على أنه متوسط ± SEM. * p < 0.05. (د) تم جمع شريحة الدماغ خارج الجسم الحي كما عولجت في (A) (بدون ورم) إما مع DMSO أو 320 nM paclitaxel وتثبيتها وفحصها ل CC3 و DAPI (تكبير الصورة 20x ، شريط المقياس: 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1. التصوير الحي لشرائح الدماغ العضوية BCBM. تم السماح لشرائح الدماغ المشتقة من الفئران التي تم حقنها داخل الجمجمة بخلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase بالنمو لمدة 4 أيام ثم وضعت تحت مجهر الصور الحية لمدة 48 ساعة حيث تم التقاط الصور كل 15 دقيقة ودمجها لإنشاء فيديو باستخدام ImageJ. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2. التصوير الحي لشرائح الدماغ العضوية BCBM المشععة. تم تشعيع شرائح الدماغ المشتقة من الفئران التي تم حقنها داخل الجمجمة بخلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase في اليوم التالي لتوليد الشرائح وبعد 4 أيام تم تصويرها كل 15 دقيقة لمدة 48 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تؤسس هذه الدراسة طريقة جديدة لزراعة الدماغ خارج الجسم الحي لأورام الدماغ xenograft المزروعة. نظهر أن خلايا BCBM MDA-MB-231BR التي يتم حقنها داخل الجمجمة في دماغ الفئران يمكن أن تبقى على قيد الحياة وتنمو في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي . اختبرت الدراسة أيضا خلايا الورم الأرومي الدبقي U87MG (GBM) المحقونة داخل الجمجمة ووجدت أيضا أن هذه الخلايا السرطانية تعيش وتنمو في شرائح الدماغ (البيانات غير معروضة). نعتقد أن هذا النموذج يمكن توسيعه إلى ما وراء BCBM و GBM إلى سرطانات أخرى تنتقل بسهولة إلى الدماغ ، بما في ذلك سرطان الرئة وسرطان الجلد. تم اختيار الحقن داخل الجمجمة لخلايا تغذية الدماغ لسرطان الثدي لأنها طريقة بسيطة وسريعة لتوليد أورام الدماغ وتعتبر نموذجا مناسبا للنقائل الكبيرة في الدماغ25. ومع ذلك ، يمكن تطوير نماذج شرائح الورم المماثلة إما من التلقيح داخل القلب أو الحقن التقويمي في منصات الدهون الأولية. إن تحسين ظروف الثقافة من خلال زراعة شرائح دماغية للبالغين في وسط خال من المصل وتوفير وسط طازج كل 48 ساعة يوفر الحفاظ بشكل أفضل على بقاء الأنسجة وبقاء الأورام ونموها. تعمل إدخالات 0.4 ميكرومتر المستخدمة في ظل ظروف فرط الأوكسيك في الحاضنة كدعم هيكلي لشرائح الدماغ خارج الجسم الحي وتوفر أيضا اتصالا بالإمداد الاصطناعي بالعناصر الغذائية والأكسجين إلى الأنسجة والخلايا السرطانية في غياب إمدادات الدم التي تبدو كافية للحفاظ على بقاء الأنسجة لمدة عشرة أيام على الأقل في الثقافة. يمثل التصوير الحي نمو الورم كدالة لزيادة إشارة GFP. ومع ذلك ، فإن البرنامج يحتوي على عتبة من لمعان GFP الأقصى الذي يشبع الإشارة ولا يسمح بالتحديد السليم لحركية الخلية الواحدة في البيئة الدقيقة للدماغ. ومن شأن التعديل المستقبلي للكشف عن إشارات البرمجيات المجهرية أن يحسن القدرة على الإبلاغ بدقة عن الزيادة الزمنية في إشارة GFP كدالة لنمو الورم.
يسمح هذا النموذج أيضا بمراقبة نمو الورم وقابليته للبقاء من خلال تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية. الأهم من ذلك ، سيسمح هذا النموذج بإجراء اختبار سريع لفعالية حساسية الإشعاع مع أو بدون مثبطات جزيئية صغيرة للأورام المزروعة في البيئة الدقيقة للدماغ. نظهر أن هذا النموذج قابل لكل من العلاجات بالإشعاع والعلاج الكيميائي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لدراسات omics مثل البروتينات والأيض والجينوم لزيادة فهم نمو السرطان والاستجابة للعلاجات داخل البيئة الدقيقة للدماغ. علاوة على ذلك ، فإن اختبار الانتكاس المحتمل للأورام عند إزالة المثبطات بعد التعرض لفترة أقصر من شأنه أن يسمح بمزيد من الفهم للمسارات المقاومة للكيماويات الفريدة للخلايا السرطانية داخل البيئة الدقيقة للدماغ.
باختصار ، قمنا بتطوير شريحة جديدة من الدماغ خارج الجسم الحي من زراعة أنسجة ورم xenograft التي من شأنها مراقبة نمو الورم والتفاعل مع البيئة الدقيقة لورم الدماغ والفحص السريع للعوامل العلاجية لمنع نمو الورم في الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون ليس لديهم صراعات مالية للإعلان.
Acknowledgments
ونود أن نشكر جوليا فارنان وكايلا غرين وتيزيانا دي أنجليس على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج منح تعزيز البحوث العالمي في الكومنولث في بنسلفانيا (MJR ، JGJ) ، UO1CA244303 (MJR) ، R01CA227479 (NLS) ، R00CA207855 (EJH) ، و W.W. Smith Charity Trusts (EjH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
