Her beskriver vi en protokol for pseudovirusemballage og måling af antistofneutraliserende aktivitet.
Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle. Lejlighedsvis bliver mennesker også ofre for det, hvilket resulterer i høj dødelighed. Ikke desto mindre hindres HPAI-virusforskning ofte, da den skal håndteres inden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus viser sig at være de ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HPAI-vira. Denne protokol beskriver procedurer og kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og pseudovirusneutraliseringsassays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays.
Siden 1996 har A/gås/Guangdong/1/96-afstamning højpatogen aviær influenza (HPAI) H5-vira forårsaget kontinuerlige influenzaudbrud hos fjerkræ og vilde fugle, hvilket tegner sig for enorme socioøkonomiske tab i den globale fjerkræindustri. Nogle gange bliver mennesker også smittet med det, der står over for en høj dødelighed 1,2. HPAI-virusforskning hindres imidlertid ofte, da den ikke kan håndteres uden for laboratorier med biosikkerhedsniveau 3. For at løse dette problem vedtages pseudovirus som et alternativ til vildtypevirus i nogle eksperimenter med H5 HPAI-undersøgelser. Pseudovirus er sikre nok til at praktisere i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2.
H5 HPAI-pseudovira tilhører kimære vira, der består af surrogatviruskerner, lipidhylstre med overfladeglycoproteiner fra influenzavirus og reportergener. Pseudoviruskerner er normalt afledt af lentiviral human immundefektvirus (HIV), retrovirus såsom murine leukæmivirus (MLV) og vesikulær stomatitisvirus (VSV)3. Specifikt anvendes HIV-1-emballagesystemet i vid udstrækning til at producere influenzapseudovirus, hvor de primære gener, der leveres, er gag og pol. HIV gag genet udtrykker kerneproteiner. Pol-genet udtrykker integrasen og revers transkriptase, som begge er nødvendige for ekspressionen af reportergenet i transducerede celler. Ved at efterligne surrogatvirusets genom omfavnes reportergenet i pseudoviruskernen i RNA-form. Reportergenet vil udtrykke proteinet i værtsceller. Genekspressionsniveauerne for reportergener kan bruges til at måle pseudovirusinfektionseffektivitet 3,4. Den primære reporter er firefly luciferase til måling af de relative luminescensenheder (RLU) eller relativ luciferase aktivitet (RLA) i transducerede celler. Andre journalister som lacZ, Gaussia og Renilla luciferase bruges også, kun i mindre grad5.
Pseudovirus er ideelle værktøjer til at studere neutraliserende antistoffer mod H5 HAPI-vira. For at måle den neutraliserende antistofstyrke anvendes pseudovirusneutraliseringsassays (PN) 6. Hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er glycoproteiner på overfladen af influenza A-virus 7,8. HA består af et kugleformet hoveddomæne til receptorbinding og et stamdomæne til membranfusion. NA-proteinet har sialidaseaktiviteten til at lette virusfrigivelsen 7,8. Et PN-assay kan måle neutraliserende antistoffer rettet mod HA-proteiner. Neutraliserende antistoffer rettet mod hoved- og stammeregionen af HA kan også påvises ved viral vedhæftning og indgangsassays. Sammenlignet med vildtypevirus har pseudovirusneutraliseringseksperimenter mere følsomme detektionsværdier, kan håndteres sikkert i et niveau 2-biosikkerhedslaboratorium og er generelt lettere at betjene i praksis.
Denne protokol præsenterer detaljeret procedurerne og de kritiske trin i H5 HPAI-pseudoviruspræparater og PN-assays. Det diskuterer også fejlfinding, begrænsning og ændringer af disse assays. I denne undersøgelse blev A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen fra H5N1 HPAI-vira anvendt som eksempel. For at opnå immunsera, der anvendes i assays, valgte denne protokol HA-proteinet, der stammer fra TH-stammen, som immunogen til immunisering af mus.
HEK293FT celler bruges normalt som emballageceller til fremstilling af pseudovirus. Regelmæssig mycoplasma-detektion er afgørende under cellekulturen. Mycoplasma-kontaminering kan drastisk reducere pseudovirusudbyttet og nogle gange tæt på nul. Sammenlignet med andre kontamineringer fører mycoplasmakontamineringer ikke til ændringer i pH-værdien eller turbiditet af cellekulturmediet. Selv en høj koncentration af mycoplasma er ikke synlig med blotte øjne eller under et mikroskop. Tre populære metoder til mycopla…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Innovation Capacity Building Project of Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), strategisk prioriteret forskningsprogram fra det kinesiske videnskabsakademi (XDB29030103), Guangdong videnskabelige og teknologiske projekt (nr. 2020B1111340076) og Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |