Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.
Abstract
Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Gans/Guangdong/1/96-Linie Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln. Gelegentlich fallen ihr auch Menschen zum Opfer, was zu einer hohen Sterblichkeit führt. Nichtsdestotrotz wird die HPAI-Virusforschung oft behindert, wenn man bedenkt, dass sie in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 durchgeführt werden muss. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren erweisen sich als ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HPAI-Viren zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudovirus-Präparaten und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert.
Introduction
Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Goose/Guangdong/1/96-Linie der aviären Influenza (HPAI) kontinuierliche Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln, die für enorme sozioökonomische Verluste in der globalen Geflügelindustrie verantwortlich sind. Manchmal infizieren sich auch Menschen damit, was mit einer hohen Sterblichkeitsrate konfrontiert ist 1,2. Die HPAI-Virusforschung wird jedoch häufig behindert, da sie nicht außerhalb von Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden kann. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren sind sicher genug, um in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 praktiziert zu werden.
H5 HPAI-Pseudoviren gehören zu den chimären Viren, die aus Surrogatviruskernen, Lipidhüllen mit den Oberflächenglykoproteinen von Influenzaviren und Reportergenen bestehen. Pseudoviruskerne stammen in der Regel vom lentiviralen humanen Immundefizienzvirus (HIV), Retroviren wie dem murinen Leukämievirus (MLV) und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV)3. Insbesondere das HIV-1-Verpackungssystem wird häufig zur Herstellung von Influenza-Pseudoviren verwendet, wobei die primären Gene gag und pol sind. Das HIV-Gag-Gen exprimiert Kernproteine. Das pol-Gen exprimiert die Integrase und die reverse Transkriptase, die beide für die Expression des Reportergens in transduzierten Zellen notwendig sind. In Anlehnung an das Genom des Surrogatvirus wird das Reportergen in RNA-Form in den Pseudoviruskern aufgenommen. Das Reportergen exprimiert das Protein in den Wirtszellen. Die Genexpressionsniveaus von Reportergenen können verwendet werden, um die Effizienz von Pseudovirusinfektionen zu messen 3,4. Der primäre Reporter ist die Glühwürmchen-Luciferase zur Messung der relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) oder der relativen Luciferase-Aktivität (RLA) in transduzierten Zellen. Andere Reporter wie lacZ, Gaussia und Renilla luciferase werden ebenfalls verwendet, nur in geringerem Maße5.
Pseudoviren sind ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HAPI-Viren zu untersuchen. Um die Potenz der neutralisierenden Antikörper zu messen, werden Pseudovirus-Neutralisations-Assays (PN)6 verwendet. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind Glykoproteine auf der Oberfläche des Influenza-A-Virus 7,8. Die HA besteht aus einer globulären Kopfdomäne für die Rezeptorbindung und einer Stammdomäne für die Membranfusion. Das NA-Protein hat die Sialidase-Aktivität, um die Virusfreisetzung zu erleichtern 7,8. Ein PN-Assay kann neutralisierende Antikörper messen, die gegen HA-Proteine gerichtet sind. Neutralisierende Antikörper, die auf den Kopf- und Stammbereich der HA gerichtet sind, können auch durch virale Attachment- und Eintrittsassays nachgewiesen werden. Im Vergleich zu Wildtyp-Viren haben Pseudovirus-Neutralisationsexperimente empfindlichere Nachweiswerte, können in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 sicher durchgeführt werden und sind in der Praxis im Allgemeinen einfacher zu bedienen.
In diesem Protokoll werden die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudoviruspräparaten und PN-Assays detailliert beschrieben. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. In dieser Arbeit wurde der Stamm A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) von H5N1 HPAI-Viren als Beispiel verwendet. Um die in Assays verwendeten Immunseren zu erhalten, wählte dieses Protokoll das aus dem TH-Stamm stammende HA-Protein als Immunogen für die Immunisierung von Mäusen aus.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT Zellen werden in der Regel als Verpackungszellen zur Herstellung von Pseudoviren verwendet. Ein regelmäßiger Mykoplasmennachweis ist während der Zellkultur unerlässlich. Eine Mykoplasmenkontamination kann die Ausbeute an Pseudoviren drastisch verringern und manchmal nahe Null liegen. Im Vergleich zu anderen Kontaminationen führen Mykoplasmen-Kontaminationen nicht zu pH-Wert-Veränderungen oder Trübungen des Zellkulturmediums. Selbst eine hohe Konzentration von Mykoplasmen ist mit bloßem Auge oder unter de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien des Innovation Capacity Building Project der Provinz Jiangsu (BM2020019), des Shenzhen Scientific and Technological Project (Nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (Nr. 2020B1111340076) und das Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (Nr. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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