Anterior Segment Organ Culture Platform zur Verfolgung von Open Globe Verletzungen und therapeutischer Leistung
Summary
Open-Globe-Augenverletzungen können in ländlichen oder militärrelevanten Szenarien mehrere Tage unbehandelt bleiben, was zu Blindheit führt. Therapeutika werden benötigt, um den Verlust des Sehvermögens zu minimieren. Hier beschreiben wir ein Organkultur-Open-Globe-Verletzungsmodell. Mit diesem Modell können mögliche Therapeutika zur Stabilisierung dieser Verletzungen richtig bewertet werden.
Abstract
Open-Globe-Verletzungen haben schlechte visuelle Ergebnisse, was oft zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führt. Dies ist zum Teil auf eine längere Verzögerung zwischen Verletzungen und medizinischen Eingriffen in ländlichen Umgebungen und militärmedizinischen Anwendungen zurückzuführen, bei denen die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist. Unbehandelte Verletzungen sind anfällig für Infektionen, nachdem das Auge seine wasserdichte Versiegelung verloren hat, sowie verlust der Gewebelebensfähigkeit aufgrund von intraokularer Hypotonie. Therapeutika zur vorübergehenden Abdichtung von Verletzungen mit offenem Globus können, wenn sie richtig entwickelt wurden, den Augeninnendruck wiederherstellen und Infektionen verhindern, bis eine ordnungsgemäße Augenheilkunde möglich ist. Um die Produktentwicklung zu erleichtern, wird hier die Verwendung einer offenen Globus-Verletzungsplattform für die organkulturelle Anterior-Segment zur Verfolgung der therapeutischen Leistung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzung detailliert beschrieben. Porcines vorderes Segmentgewebe kann in speziell angefertigten Organkulturschalen gehalten und bei physiologischem Augeninnendruck gehalten werden. Punktionsverletzungen können mit einem pneumatisch angetriebenen System erzeugt werden, das Verletzungsgrößen von bis zu 4,5 mm Durchmesser erzeugen kann, ähnlich wie militärisch relevante Verletzungsgrößen. Ein Verlust des Augeninnendrucks kann 72 Stunden nach der Verletzung beobachtet werden, was die ordnungsgemäße Verletzungsinduktion und den Verlust der wasserdichten Augendichtung bestätigt. Die therapeutische Leistung kann durch Anwendung auf das Auge nach Verletzungsinduktion und anschließender Verfolgung des Augeninnendrucks für mehrere Tage verfolgt werden. Darüber hinaus ist das Anterior-Segment-Verletzungsmodell auf weit verbreitete Methoden zur funktionellen und biologischen Verfolgung der Physiologie des vorderen Segments anwendbar, wie z. B. die Beurteilung von Transparenz, Augenmechanik, Hornhautepithelgesundheit und Gewebelebensfähigkeit. Insgesamt ist die hier beschriebene Methode ein notwendiger nächster Schritt zur Entwicklung von Biomaterialtherapeutika zur vorübergehenden Versiegelung von Verletzungen am offenen Globus, wenn die Augenheilkunde nicht ohne weiteres verfügbar ist.
Introduction
Open Globe (OG)-Verletzungen können zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens führen, wenn sie nach einer Verletzung nicht behandelt oder zumindest stabilisiert werden1. Verzögerungen sind jedoch in abgelegenen Gebieten weit verbreitet, in denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen nicht ohne weiteres möglich ist, wie in ländlichen Gebieten oder auf dem Schlachtfeld in militärischen Szenarien. Wenn die Behandlung nicht ohne weiteres verfügbar ist, besteht der derzeitige Behandlungsstandard darin, das Auge mit einem starren Schild zu schützen, bis ein medizinischer Eingriff möglich ist. In der Militärmedizin beträgt diese Verzögerung derzeit bis zu 24 Stunden, aber es wird erwartet, dass sie in zukünftigen Kampfeinsätzen in städtischen Umgebungen, in denen eine Luftevakuierung nicht möglichist,auf bis zu 72 Stunden ansteigen wird2,3,4. Diese Verzögerungen können in ländlichen, abgelegenen zivilen Anwendungen, bei denen der Zugang zu ophthalmologischen Eingriffen begrenztist,noch länger sein5,6. Eine unbehandelte OG-Verletzung ist sehr anfällig für Infektionen und Verlust des Augeninnendrucks (IOP), da die wasserdichte Versiegelung des Auges beeinträchtigt ist7,8. Der Verlust des IOD kann die Lebensfähigkeit des Gewebes beeinträchtigen, so dass es unwahrscheinlich ist, dass ein medizinischer Eingriff das Sehvermögen wiederherstellt, wenn die Verzögerung zwischen Verletzung und Therapie zu lang ist9.
Um die Entwicklung einfach anzuwendender Therapeutika zur Abdichtung von OG-Verletzungen zu ermöglichen, bis ein Augenarzt erreicht werden kann, wurde zuvor ein Benchtop-OG-Verletzungsmodell entwickelt10,11. Bei diesem Modell wurden Hochgeschwindigkeitsverletzungen in ganzen Schweineaugen erzeugt, während IOD von Druckaufnehmern erfasst wurde. Therapeutika können dann angewendet werden, um ihre Fähigkeit zu beurteilen, die OG-Verletzungsstelle zu versiegeln12. Da dieses Modell jedoch ganze Schweineaugen verwendet, kann es nur die sofortige therapeutische Leistung beurteilen, ohne dass die längerfristige Leistung über das mögliche 72-Stunden-Fenster verfolgt werden kann, in dem das Therapeutikum die Verletzungsstelle stabilisieren muss, bis der Patient die Spezialbehandlung erreicht. Infolgedessen wurde ein anteriores Segment Organ Culture (ASOC) OG-Verletzungsmodell entwickelt und in diesem Protokoll als Plattform zur Verfolgung der langfristigen therapeutischen Leistungdetailliert beschrieben 13.
ASOC ist eine weit verbreitete Technik zur Aufrechterhaltung von avaskulärem Gewebe des vorderen Segments, wie der Hornhaut, für mehrere Wochen nach der Enukleation14,15,16,17. Das vordere Segment wird unter physiologischem IOD aufrechterhalten, indem Flüssigkeit mit physiologischen Durchflussraten durchschränkt wird und die trabekuläre Netzabflussregion, das Gewebe, das für die Regulierung des IOD verantwortlich ist, während des ASOC-Setups erhalten bleibt18,19. Die ASOC-Plattform kann Gewebe physiologisch erhalten, eine OG-Verletzung mit einem pneumatisch betriebenen Gerät induzieren, ein Therapeutikum anwenden und die Verletzungsstabilisierung für mindestens 72 Stunden nach der Verletzungverfolgen 13.
Hier bietet das Protokoll eine Schritt-für-Schritt-Methodik für die Verwendung der ASOC-Plattform. Zuerst wird beschrieben, wie die ASOC-Plattform eingerichtet und hergestellt wird. Als nächstes beschreibt das Protokoll, wie das vordere Segment aseptisch seziert und das trabekuläre Geflecht beibehalten wird, gefolgt von der Einrichtung von vorderem Segmentgewebe in speziell angefertigten Organkulturschalen. Dann wird beschrieben, wie man Open-Globe-Verletzungen erzeugt und therapeutisch unmittelbar nach der Verletzung anwendet. Schließlich bietet das Protokoll einen Überblick über Charakterisierungsparameter, die mit dieser Methode möglich sind, die funktionelle, mechanische und biologische Eigenschaften des Auges bewertet und wie gut die Verletzung stabilisiert wurde. Insgesamt bietet dieses Modell eine dringend benötigte Plattform, um die Produktentwicklung zur Stabilisierung und Behandlung von Open-Globe-Verletzungen zu beschleunigen und die Schlechtesichtprognose nach Verletzungen zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt kritische Schritte mit der ASOC OG-Verletzungsplattform, die hervorgehoben werden sollten, um die Erfolgswahrscheinlichkeit bei der Verwendung der Methodik zu verbessern. Erstens ist es während der Dissektion des vorderen Segments wichtig, das trabekuläre Geflecht zu erhalten, aber es ist schwierig, es richtig zu machen. Wenn das TM gestört ist, hält das Auge den physiologischen Druck nicht aufrecht und erfüllt nicht die Zulassungskriterien für die experimentelle Verwendung. Es wird empfohlen, den Dissektio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten durch eine behördenübergreifende Vereinbarung (#19-1006-IM) mit dem Temporary Corneal Repair Acquisition Program (United States Army Medical Materiel Development Agency) unterstützt werden.
Materials
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
Riferimenti
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