Summary
本稿では,ラットの大腿骨顆軟骨損傷を20N以上60回周期的に圧迫することにより生じたラット膝の周期的荷重誘発関節内軟骨病変モデルを提示する.
Abstract
原発性変形性関節症(OA)の病態生理は不明のままである。しかし、比較的若い年齢層におけるOAの特定の下位分類は、関節軟骨損傷および靭帯剥離の病歴と相関している可能性が高い。膝のOAの外科動物モデルは、心的外傷後OAの発症と進行を理解する上で重要な役割を果たし、この病気の新しい治療法の開発に役立ちます。しかし、非外科的モデルは、介入の評価に影響を与える可能性のある外傷性炎症を回避するために最近検討されている。
この研究では、 in vivo 周期圧縮負荷によって誘発される関節内軟骨病変ラットモデルが開発され、研究者は(1)局所軟骨損傷を引き起こす可能性のある負荷の最適な大きさ、速度、および持続時間を決定することができました。(2)軟骨細胞の活力における心的外傷後時空間病理学的変化を評価する。(3)関節圧縮荷重に対する適応および修復メカニズムに関与する破壊的または保護的分子の組織学的発現を評価する。この報告では、ラットモデルにおけるこの新しい軟骨病変の実験プロトコルについて説明します。
Introduction
伝統的に、前十字靭帯(ACL)の切断または内側半月板の不安定化は、小動物の心的外傷後変形性関節症(PTOA)の調査に最適であると考えられてきました。近年、非侵襲的な周期的圧縮モデルがPTOAの研究に使用されています。このモデルはもともと機械的負荷に対する海綿骨の反応を調査するために設計され1、その後、PTOA研究2,3,4,5,6の非外科的動物モデルとして変更されました。理論的根拠は、一連の炎症反応を引き起こす周期的な外力を加えることによって関節軟骨を衝突させることです。しかし、このモデルはマウスにのみ適用されており、より大きな動物への負荷の適切な大きさは議論されていませんでした。
以前のモデルの別の問題は、大量のプロトコルに含まれるサイクルが多すぎるため、いくつかのサンプルで軟骨下骨の過度の肥厚、望ましくない副作用を引き起こしたことです7。そこで、大型動物に適した大きさで負荷の副作用が低い新しい周期圧縮法が開発されました8。現在の記事の全体的な目標は、ラットの非侵襲的周期的圧迫モデルのプロトコルを説明し、軟骨変性の代表的な結果を観察することです。現在のプロトコルは、ラットへの非侵襲的周期的圧縮モデルの適用に関心のある読者を助けるでしょう。
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Protocol
京都大学動物研究委員会(承認番号:医学教17616)により承認されました。
1.ラットの膝に in vivo 周期的圧迫を実行します
- 実験動物の麻酔を誘発する
- 麻酔ボックス内の5%イソフルラン溶液を吸入することにより、12週齢のWistarラット(256.8 ± 8.7 g)に麻酔を誘発します。.
- メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールを含む3種類の麻酔薬9の混合物をラット体重2 mg / kgで腹腔内注射し、右膝関節周辺を剃ります。.つま先ピンチへのペダル反射の欠如による十分な麻酔を確認します。
- 麻酔をかけたラットを固定装置に取り付けます。
- 麻酔をかけたラットを腹の上に置き(図1)、右膝を凹状の溝のある樹脂片に取り付けます。右後肢を股関節伸展、膝屈曲、足首伸展の位置に置き、膝を約140°曲げます。可動器具のくさび形の溝にラットのかかとを収容します。
- 固定装置を応力/引張試験装置に移動します( 材料の表を参照)。ロードセルとの接触がないことを確認したら、応力/引張試験機制御ソフトウェア(材料表)を開き、[ キャリブレーション ]ボタンをクリックします。キャリブレーション後、フレームの上部をロードセルに慎重に取り付けます。膝関節をフレームにしっかりと取り付けたままにするには、可動式のメイン操作パネルの回転ノブを、予圧が5Nに達するまでゆっくりとオンにします。
- 荷重方法を構築し、圧縮試験を設定します。
- メインメニューで、[新しいメソッドの作成]をクリックします|システムラベル。[テスト モード] を [サイクル] に設定し、[テスト タイプ] を [圧縮] に設定します。[センサー] ラベルをクリックし、[テスト] タブを選択して、制限が 60 N 以内であることを確認します。さらに、[ストローク]タブを選択し、制限が500mm以内であることを確認します。
注意: 上記の手順では、応力点に大きな変位がある場合、操作がすぐに停止します。 - テストコントロールラベルの下で、成長の起源を選択して、0.3%/フルスケールでメインプログラムを開始します。荷重サイクルの4つのセクションのうち、第1および第3セクションの制御ストローク速度を1mm/sに設定します。2番目のセクションの最大試験力を20Nに設定し、4番目のセクションの最小試験力を5Nに設定します。 「保持期間」をピーク負荷の場合は0.5秒、最小負荷の場合は10秒に設定します(図2)。
注意: この手順ではすべてのサイクルを定義するため、ジョイントサーフェスが互いに接触し、妥当な速度で移動していること、およびモーションが維持されていることを確認してください。 - ページの下部にある[ プリロード ]タブで、[オン]が オン になっていること、[ たわみ除去速度 ]が100 mm/minに設定され、 最大力 が5 Nであることを確認します。[ 試験片] ラベルで、[ 材料 ]を [金属]に設定します。
注: これらの詳細設定は、製造元ごとに異なる場合があります。 - [メイン] メニューの [メソッドとテストの選択] セクションで、ビルドしたメソッドを選択し、[開始] をクリックしてテストを開始します。
注意: 下部の表は、ピーク荷重と変位の実際の測定値を示しています。 - サイクル数を60に設定します。
注意: ロードセッション全体には60サイクルが含まれ、約12分続きます。対照群では、ラットは同じ条件下で12分間プレロードのために5Nプレロードを受けた。
- メインメニューで、[新しいメソッドの作成]をクリックします|システムラベル。[テスト モード] を [サイクル] に設定し、[テスト タイプ] を [圧縮] に設定します。[センサー] ラベルをクリックし、[テスト] タブを選択して、制限が 60 N 以内であることを確認します。さらに、[ストローク]タブを選択し、制限が500mm以内であることを確認します。
- ロード後、ラットをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。十分なスペースと食物の自由でケージ内で12〜12時間の明暗スケジュールを維持します 。 必要な実験期間の後、分析のために腹腔内または二酸化炭素吸入(1時間〜8週間)に注射された3つの麻酔薬の混合物の過剰摂取でラットを屠殺する。
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Representative Results
20 Nの周期負荷を受けたサンプルの軟骨細胞の生存率の短期的変化(1時間および12時間)の代表的な結果が得られました。 図3に示すように、死骸軟骨細胞数(赤色蛍光)は外傷後12時間で増加した。逆に、生きた軟骨細胞の数(緑色蛍光)は減少し続け、患部に生きた軟骨細胞を含まないサンプルもありました。
組織学的には、20N動的荷重を受けたラット膝の関節軟骨が損傷しており、すべてのサンプルで外側大腿骨顆に1つの限局性病変ゾーンが確認されました(図4)。しかし、病変の大きさは8週間の観察期間中に徐々に増加しなかった。病変と影響を受けていない軟骨の界面に対応する境界が患部に観察された。
図1:固定装置は、地板と固定装置で構成されています。 ベースプレート(長さ:27.5 cm、幅:13 cm)は、ラットの屈曲した膝関節を収容するために、後側に樹脂製の凹溝(長さ:0.8 cm、幅:0.4 cm)があります。固定装置は、ラットのかかとを収容するくさび形の溝(溝幅:1.5cm、溝深さ:1cm)を有し、ラットのかかとを収容し、2本の金属棒の間のベースプレートにネストされている。固定装置の上部は、応力/引張試験装置のロードセルに直接接触します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:1サイクルの荷重プロファイル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:病変領域における軟骨細胞の生存率の時空間評価。 犠牲の後、膝関節を解剖し、小さな鉗子とはさみを使用して分離した。カルセインAMおよびEthD-1染色剤の溶液は、元のキット(材料表)をそれぞれ5mLのPBSで1:500および1:4,000に希釈することによって調製した。サンプルを室温で20分間インキュベートした。対照試料を同条件でPBSに浸漬した。蛍光画像は、フルオレセインイソチオシアネート(495 nm / 519 nm)およびヨウ化プロピジウム(535 nm / 617 nm)チャネルを使用して蛍光顕微鏡(材料表)を使用して取得しました。重要な軟骨細胞は緑色の蛍光を示し、死細胞は赤色の蛍光を発しました。対照サンプル(A)の軟骨細胞と比較して、負荷されたラット膝上の死んだ軟骨細胞の数は1時間で増加し(B)、12時間で患部の領域の大部分を占めました(C)。緑と赤の蛍光は、それぞれ生きている軟骨細胞と死んだ軟骨細胞の領域を表します。スケールバー= 100μm。略語:カルセインAM =カルセインアセトキシメチルエステル;EthD-1 = エチジウムホモ二量体-1;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:負荷を受けた膝の大腿骨顆の代表的なサフラニンO染色。 サフラニンO/ファストグリーンとヘマトキシリン溶液で染色した外側大腿骨顆の矢状切片を示すスライド。コントロールと比較して、負荷後に患部のサフラニンO染色強度が低下し、上部/石灰化した軟骨の明確な境界(矢印)が観察されました。スケールバー= 100μm。省略形: w = 週。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在のプロトコルは初めて、マウス2などの小さなげっ歯類の関節内損傷モデルと同様に、ラットの外側大腿骨顆に負荷誘発軟骨病変のモデルを確立する方法を示しています。しかし、マウスの負荷プロトコルは重度の骨棘形成と十字靭帯病変を引き起こし、周期的圧迫の効果を評価するのに理想的ではありませんでした。現在のプロトコルは、はるかに低い負荷力でラットに限局性軟骨病変を作成しました。適切な大きさ、速度、および持続時間のストレスのみが骨組織に損傷を与えることなく軟骨を破壊できるため、正しい負荷方法の設定はプロトコルにとって重要です。
変位限界の設定(プロトコルステップ1.3.1)は、靭帯が破裂した場合、またはラットが負荷セッション中に麻酔から目覚めた場合に機器を直ちに停止するため、非常に重要です。最適な最大負荷およびラットの年齢はまだ決定されていない。しかし、予備実験では、50Nを超える荷重により、ラットの膝にACL破裂の可能性が高い。さらに、現在のモデルは、おそらく成長が起こるにつれて軟骨の硬さのために、高齢(>36週齢)ラットで再現するのが困難です。
若いラットの破壊負荷閾値は決定されていませんが、軟骨への同化作用を観察するために、将来の研究では最大負荷を20 N未満に保つ必要があると考えられています。病変領域の範囲と局在は、各サンプルの軟骨細胞変性体積によって推定されるように、この分野に不慣れな人でも比較的簡単に確立でき、比較的狭い軟骨領域への介入のその後の評価に焦点を当てた可能性があります。
組織学的染色により、8週間の観察期間中、病変領域の範囲は比較的安定していたことが示されました。しかし、マンキンのスコアは継続的に悪化し、マトリックス染色と細胞分布スコアは患部で増加しました。さらに、中間層と石灰化した軟骨の間に明らかな色のずれがあり、潮汐より上の軟骨のみが関節間圧迫の影響を受けていることが示されました。
それどころか、まれなサンプルでの軽度の細動を除いて、軟骨の完全性は観察期間全体を通してほとんど無傷のままであり、これは進行性のOA損傷モデル10とは異なります。したがって、非外科的モデルは、スポーツ傷害でより一般的な軟骨界面衝突誘発性病巣の評価に適している可能性があります。将来的には、現在のモデルを使用して、温熱療法や有酸素関節運動などの薬物療法または理学療法が外傷性軟骨損傷に及ぼす影響を評価します。さらに、周期的な機械的刺激に応答する軟骨細胞の同化作用および異化作用も、このモデルを用いた動物において in vivo で検証することができた。
現在のプロトコルにはいくつかの制限がありました。まず、外側大腿骨顆の軟骨病変のみを調べた。外側脛骨の病変も将来の研究で評価されるべきです。第二に、現在のプロトコルで研究された関節軟骨の病変部分は、歩行中の主要な負荷負荷領域ではありませんでした。軟骨の不均一性のために、関節内軟骨の剛性は、現在の研究で調べられた部分と異なる場合があります。したがって、これらの調査結果は参照としてのみ使用できます。最後に、このモデルは、OA開発の重要な特徴である軟骨変性の有意な進行を示さなかった。さらなる研究では、侵襲的手術とプリロードされた病変を組み合わせて、時空間変化を観察することができます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
本研究の一部は、JSPS科研費助成(JP18H03129、JP18K19739)の助成を受けて行われました。
この研究はまた、Eunice Kennedy Shriver国立小児保健人間発達研究所(NICHD)、国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)、および国立衛生研究所の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)の支援を受けているAlliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training(AR3T)からも資金提供を受けています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
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