Summary
Dette er en metode for å isolere livmor lymfoide celler fra både gravide og ikke-gravide mus. Denne metoden kan brukes til flere nedstrømsprogrammer som FACS-fenotyping, cellesortering, funksjonelle analyser, RNA-seq og proteomikk. Protokollen her demonstrerer hvordan fenotype gruppe 1 livmor medfødte lymfoide celler ved strømning cytometri.
Abstract
Beskrevet her er en enkel metode for å isolere og fenotype musegruppe 1 livmor medfødte lymfoide celler (g1 uILCs) fra individuell gravid livmor ved strømning cytometri. Protokollen beskriver hvordan du setter opp tidsparring for å oppnå flere synkrone dammer, den mekaniske og enzymatiske fordøyelsen av den gravide livmoren, farging av encellede suspensjoner og en FACS-strategi for fenotype og diskriminere g1 uILCs. Selv om denne metoden uunngåelig mister den romlige informasjonen om cellulær distribusjon i vevet, har protokollen blitt brukt til å bestemme uILC-heterogenitet, deres respons på mors- og fosterfaktorer som påvirker graviditet, deres genuttrykksprofil og deres funksjoner.
Introduction
Beskrevet her er en enkel metode for å oppnå et høyt utbytte av livmor medfødte lymfocytter fra individuell gravid livmor. Denne metoden bevarer proteinoverflateuttrykk og funksjonalitet av livmor medfødte lymfocytter, og den er egnet for etterfølgende applikasjoner som FACS fenotyping, RNAseq, proteomikk eller funksjonelle analyser. Her er fokuset på fenotyping av gruppe 1 uILCs ved flowcytometri.
Livmoren består av tre lag: endometrium, myometrium og perimetrium (figur 1). Endometrium er slimhinnen, fôrer livmorens lumen. Progesteron, produsert av corpus luteum, konverterer endometrium til decidua. Myometrium består av to lag med glatt muskel som utgjør livmorveggen. Perimetrium er serosa som pakker livmoren og forbinder den til bukhinnen gjennom det brede ligamentet kalt mesometrium. I et tverrsnitt av livmoren kalles delen motsatt lumen den mesometriale siden, mens delen nær lumen kalles anti-mesometrial side. En rekke mors leukocytter fyller endometrium og decidua, inkludert flere typer celler, hvor de medfødte immuncellene representerer de aller fleste celler. Medfødte lymfoide celler (ILCs), makrofager, dendritiske celler (DC), samt CD4 + og CD8 + T lymfocytter, regulatoriske T-celler (Tregs) og sjeldne B-celler, kan alle spille viktige roller i reguleringen av livmormiljøet gjennom graviditet1,2. ILCer i livmoren finnes ikke bare i slimhinnen, men også i myometrium hos mus. Inkludert alle tre gruppene av ILCer, livmor er faktisk orgelet tettest befolket av gruppe 1 ILCer. Med den strukturelle transformasjonen av livmorvev gjennom svangerskapet endres også antallet og andelen livmor leukocytter (se figur 2A for et eksempel på variasjoner i prosentandelen av gruppe 1 uILC-delsett)3,4.
Når mus refereres til i dette papiret, er C57BL /6-stammen av innavlede laboratoriemus ment. Utrangerte mus (f.eks. NMRI-mus) brukes ofte i reproduktiv forskning på grunn av deres høye reproduksjonshastighet. Imidlertid er bruk av innavlsstammer nødvendig for å generere konsistente resultater, og immunologens favoritt genetiske bakgrunn er C57BL / 6, også kjent som B6.
Omtrent 30% av livmor leukocytter i B6 dammer ved midten av svangerskapet er g1 uILCs, som er definert av flowcytometri som levedyktig CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+-celler (figur 2B): pro-angiogen vevsresident NK (trNK), IFN-g som produserer konvensjonell NK (cNK) og uILC14,5. Prosentandelen av uNK-celler er enda høyere hos mennesker, og når ca 70% i første trimester6. Det er flere likheter enn forskjeller mellom menneske og mus uNK og uILC7,8. Selv om det er viktig å huske på forskjellene, er det nyttig å integrere informasjon som er tilgjengelig på de to artene. Når man kombinerer informasjon hentet fra å undersøke uILC hos mennesker og laboratoriegnagere, er det klart at NK-celler hjelper til med homeostatiske endringer som er avgjørende for livmorens biologi, inkludert vedlikehold av arteriell integritet9 og spiralarterieoppussing10, samt trofoblalastinvasjon11,12. De spiller også spesifikke roller i forsvaret mot patogener13,14. Hos mus og rotter, foruten å fylle decidua rundt implantasjonsstedet, akkumuleres NK-celler mellom de to muskellagene i myometriumet av dammer i en forbigående struktur kjent som Mesometrial Lymphoid Aggregate of pregnancy (MLAp)15 (Figur 1B), også kjent tidligere som metrialkjertelen, hvis funksjon ennå ikke er oppdaget.
Beskrevet her er en detaljert protokoll av metoden som brukes i laboratoriet for å isolere lymfocytter fra livmoren til gravide mus ved hjelp av en kombinasjon av mekanisk disaggregation og enzymatisk fordøyelse. Siden hele livmoren brukes i metoden, er lymfocytter isolert fra livmoren under svangerskapet en blanding av løvceller og myometrieceller. Videre disseksjon av decidua fra livmorveggen og mlap er mulig, og det har blitt beskrevet før16. Metoden beskrevet her ble utviklet for å oppnå livmor lymfocytter samtidig bevare protein overflateuttrykk, cellulær funksjonalitet og levedyktighet. Utfallet er en enkeltcellet suspensjon med minimal gjenværende cellulært rusk og et utbytte som vanligvis spenner fra 1-5 millioner celler ved midten av svangerskapet (10,5 dager) for en gravid livmor. Anvendelsen av denne metoden omfatter fenotyping ved strømningscytometri, cellesortering for etterfølgende transkripsjons- eller proteomiske studier, funksjonelle studier som intracellulær cytokinproduksjon, degranulering, ELISPOT eller cytotoksiske analyser. Protokollen som presenteres her fokuserer på å identifisere gruppe 1 ILCer, men kan tilpasses andre celletyper som andre ILCer, T-celler, B-celler, DC eller makrofager med mindre modifikasjoner av antistoffpanelet som brukes til FACS-analyse. Protokollen kan også brukes til å isolere celler fra andre vev og for samlet ikke-gravid uteri.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet i denne artikkelen ble utført i henhold til Animals (Scientific Procedures) Act 1986 under PP2363781 utstedt av UK Home Office. Protokollen nedenfor består av flere seksjoner som starter fra mushold og etterbehandling med farging for FACS-analyse. Figur 3 gjenspeiler hovedtrinnene i protokollen. Materialene som brukes i protokollen er oppført i materiallisten.
1. Generell mushold, parring og disseksjon
- Hold 7-14 uker gamle kvinnelige mus under spesifikke patogenfrie (SPF) forhold og gruppehus (vanligvis 4-6 kvinner i henhold til burstørrelse og dyrevekt), i 10-14 dager for å utløse Lee-Boot-effekten, noe som resulterer i østrussynkronisering17.
- Hold studhannene i SPF-forhold, enkelthus og uthvilt i minst 48 timer mellom hver parring (tid for sædregenerering). Det er å foretrekke å bruke erfarne beviste 3-4 måneder gamle stud menn som de er vanligvis mer performant enn de unge.
- For å øke sannsynligheten for at kvinner blir gravide, introdusere skittent sengetøy fra en manns bur i det kvinnelige buret 3 dager før parring. Dette utløser Whitten-effekten18 ved eksponering for mannlige urinferomoner, og resulterer i synkronisert østrus samt forbedret mottakelighet for parring.
- På dag 0 (D0) setter du opp musene for parring ved hjelp av en stud mann per to kvinner; vurdere en plugghastighet på ca. 20%-25%.
MERK: Parring vil sannsynligvis skje om natten siden mus er nattlige dyr. - Om morgenen etter parring (D0,5), kontroller om det finnes en vaginal plugg, som er en indikator på kopiering (figur 4). Vaginalpluggen er et aggregat av den mannlige ejakulatet og vedvarer vanligvis i opptil 8-24 timer etter parring. Sjekk pluggene tidlig om morgenen.
- Konsolider de pluggede hunnene i et nytt bur og øremerke dem. Returner mennene til burene sine for hvile.
- Ved D9,5 eller 10,5-etter parring, lag 5 ml rør med 1 ml steril HBSS 1x (med Mg2+ og Ca2+) for vevsoppsamling og legg dem på is.
- Fortsett til dyr eutanasi ved cervical dislokasjon, etterfulgt av exsanguination for å bekrefte døden.
- Arbeid i et sterilt miljø hvis nedstrømsapplikasjonen krever det. Rett etter eutanasi, tørk musekroppen med 70% etanol og fortsett å dissekere under et laminært fluksskap med sterile instrumenter.
- Disseker den gravide livmoren fri for mesometrialt fett (figur 5) og legg hele livmoren i et forberedt og passende merket 5 ml rør. Hold rørene på is.
2. Mekanisk og enzymatisk fordøyelse av livmoren
- For å forberede den enzymatiske fordøyelsesløsningen blander du 3 ml per livmor av steril HBSS 1x med 30 μg/ml DNAse og 0,1 Wünsch-enhet (WU)/ml Liberase DH eller 0,52 WU/ml Liberase TM. Sett løsningen i et vannbad ved 37 °C.
MERK: Både Liberase TM og Liberase DH kan brukes. Valget av den ene over den andre må styres av deres potensielle effekt på epitoper anerkjent av antistoffer som brukes til etterfølgende strømningscytometrianalyse.
FORSIKTIG: Hvis du bruker lyofiliserte enzymer, må du arbeide under hetten. - Forbered 20 ml 5 mM EDTA i PBS (ingen Ca2+/Mg2+). Plasser halvparten av oppløsningen ved 37 °C i et vannbad og den andre halvparten på is.
- Under et laminært fluksskap fjerner du forsiktig fettet rundt den gravide livmoren med sterile instrumenter i en steril Petri-tallerken. Ikke la vevet tørke.
- Disseker hvert implantasjonssted med sterile instrumenter for å fjerne fostrene (sjøhestformet translucidstruktur, rundt 1 mm i lengde) (figur 6A). Kast fostrene.
- Returner livmoren til sin opprinnelige samling 5 ml rør og hakk vevet ved hjelp av saks direkte i 5 ml rør og oppsamlingsmedium. Hold rørene på is hele tiden mellom prosedyrene.
- Plasser de 5 ml rørene som inneholder hakket vev i et vannbad ved 37 °C.
- Tilsett 3 ml varm enzymatisk fordøyelsesblanding til hver prøve, slik at det totale volumet av væske i røret er 4 ml (1 ml oppsamlingsmedium med hakket livmor og 3 ml enzymatisk fordøyelsesløsning). Inkuber 5 ml rør i 30 min ved 37 °C med agitasjon for å forbedre enzymatisk fordøyelsesaktivitet.
- Virvel de 5 ml rørene og legg dem på is for å hemme virkningen av enzymer. Deretter overfører du innholdet til riktig merkede 15 ml sentrifugerør.
- Skyll alt ut av de 5 ml rørene inn i 15 ml sentrifugerørene ved hjelp av 10 ml iskald 5 mM EDTA PBS-løsning.
- Sentrifuger de 15 ml sentrifugerørene som inneholder det fordøyde vevet i 10 min ved 400 x g.
- Kast den supernatante, flikk pelletsen forsiktig, og bruk den deretter på nytt i 10 ml varm (37 °C) 5 mM EDTA PBS-oppløsning.
- Inkuber prøvene i 15 ml sentrifugerør ved 37 °C med agitasjon i 15 minutter for å fjerne venstre fordøyelsesmedium og redusere celleklumpingen.
- Virvel prøvene på høy i 10 s for å ytterligere lette vev dissosiasjon.
3. Behandling av livmoren i en enkelt celle suspensjon
- Bruk stempelet på en steril 1 ml sprøyte, tving det fordøyde vevet gjennom en 70 μm sil på et riktig merket og sterilt 50 ml sentrifugerør for å fjerne celleklumpene og det udisosierte vevet.
- Vask silen flere ganger med totalt 10 ml kald PBS for å samle alle cellene.
- Snurr 50 ml sentrifugerøret i 10 min ved 400 x g.
MERK: Utfør de videre trinnene ved hjelp av alternativ A eller alternativ B. Alternativ A gir bedre berikelse av lymfocyttene med mindre rusk og stromal celleforurensning enn alternativ B. Alternativ B gir imidlertid høyere immuncelleutbytte på grunn av mindre celletap og mindre variasjon i celleutbyttet mellom prøver. Alternativ B er også enklere å utføre teknisk. Derfor, avhengig av preferanse, fortsett med alternativ A eller alternativ B.- Trinnene for alternativ A er som følger.
- Merk ett sterilt 15 ml sentrifugerør per prøve som inneholder 5 ml 80 % (v/v) isoton percoll fortynnet i PBS.
- Etter spinnet, kast supernatanten fra 50 ml sentrifugerøret. Bruk en pipet gutt til å resuspend hver pellet i 8 ml av 40% (v / v) isotonisk percoll i PBS.
- Bruk en pipet gutt på langsom hastighet for å forsiktig legge pellet resuspended i 40% Percoll løsning på 80% Percoll løsning. Pipette sakte og kontinuerlig; 15 ml-røret i en vinkel på 45° (figur 6B).
- Uten å forstyrre overlegget, sentrifugerer du de 15 ml sentrifugerørene i 20 minutter ved 850 x g, ved romtemperatur (middels akselerasjon og minimal pause).
- Fjern rørene forsiktig fra sentrifugen uten å forstyrre Percoll-lagene (figur 6C).
- Uten å forstyrre leukocyttenes ring ved grensesnittet til de to Percoll-løsningene, bruk en steril Pasteur Pipette for å kaste alle unntatt ca. 0,5-1 ml av det øverste Percoll-laget.
- Mens du prøver å suge en minimumsmengde Percoll-løsning (opptil 4-5 ml totalt), samle forsiktig ringen av leukocytter og overfør cellene til et nytt merket 15 ml sentrifugerør.
- Fyll opp hver prøve med 10 ml sterilt RMPI-1640 medium supplert med 10% varmeinaktivert FBS.
- Sentrifuge i 5 min ved 500 x g ved 4 °C.
- Kast supernatanten og fortsett til RBC lysis.
- Trinnene for alternativ B er som følger.
- Merk ett sterilt 15 ml sentrifugerør per prøve.
- Etter spinnet, kast supernatanten fra 50 ml sentrifugerøret. Bruk en pipet gutt til å resuspend hver pellet med 8 ml av 35% (v / v) isotonisk percoll i RPMI-1640 medium.
- Overfør prøvene til 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger prøvene på 940 x g i 10 minutter ved romtemperatur med middels akselerasjon og minimal pause.
- Aspirer supernatanten forsiktig ved hjelp av en aspirator eller pipettegutt (ikke ved å invertere røret).
- Resuspend pellet i 14 ml RPMI-1640 medium supplert med 10% varmeinaktivert FBS og deretter sentrifugere prøven ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Kast supernatanten ved aspirasjon og fortsett til RBC lysis.
- Trinnene for alternativ A er som følger.
4.RBC lysis
- For å lyse RBCene, resuspend prøvene i 3 ml 1x RBC lysing løsning og inkubere i 3 min ved romtemperatur.
- Tilsett 10 ml PBS i prøvene for å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuger rørene på 400 x g i 5 min og kast supernatanten.
- Tilsett 10 ml PBS, og gjenta trinn 4.3.
- Resuspend hver pellets i 1 ml RPMI-1640 medium supplert med 10% av varmeinaktivert FBS.
- Før prøvene gjennom sterile 70 μm cellesiler.
- Utfør celleantallet ved hjelp av trypan blue og et Neubauer Chamber i henhold til produsentens instruksjoner.
- Juster konsentrasjonen av cellefjæringen til 1-2 millioner celler i 100 μL PBS eller medium.
5. Paneldesignstrategi og kontroller
MERK: Panelet som er beskrevet i dette dokumentet, er egnet for diskriminering av uILC1-, trNK- og cNK-celler og ble designet for å brukes på en 5-laser BD LSRFortessa. Mindre modifikasjoner kan gjøres for å studere forskjellige cellepopulasjoner og bruke alternative fluorokromer. Det anbefales å sjekke konfigurasjonen av instrumentet, ved hjelp av titrerte antistoffer for optimal separasjon, konsultere produsentens lysstyrkeindeks og bruke de lyseste fargestoffene for lavt uttrykkende antigener som NKp46, og etter generelle retningslinjer19. Det anbefales å inkludere en Fluorescence Minus One (FMO)-kontroll for NKp46.
6. Medfødt lymfoid cellefarging for FACS fenotyping
- Overfør 1-2 millioner celler per brønn til en rundbunns 96-brønnsplate.
- Snurr platen ved 400 x g i 3 min ved 4 °C og kast supernatanten ved å flikke den inn i en vask.
- Resuspend cellepellets i 100 μL PBS (protein og azide-fri) ved hjelp av en flerkanals pipette.
MERK: Kontroller at PBS ikke inneholder natriumazid, tris eller proteiner for det påfølgende trinnet. - Gjenta trinn 6.2.
- Resuspendceller i 50 μL fikserbar levedyktighetsfarge fortynnet i PBS (protein og azidefri) (1:1,000). Inkuber cellene ved romtemperatur i 30 min i mørket.
MERK: Forsikre deg om at PBS ikke inneholder natriumazid, ingen Tris eller proteiner som FBS eller BSA, da dette kan føre til redusert fargingsintensitet av døde celler og / eller økt bakgrunnsfarging for levende celler.
FORSIKTIG: Hvis levedyktighetsfargen er pulverisert, bruk under panseret. - Tilsett 150 μL PBS, resuspend cellene med en flerkanals pipette, og gjenta deretter trinn 6.2.
- Resuspend cellene i 25 μL av FACS Buffer (PBS supplert med 1% BSA eller 2% FBS) som inneholder Fc reseptor blokkering reagens. Inkuber cellene i 5 min ved 4 °C.
- Tilsett 25 μL av en overflate antistoffcocktail.
MERK: Titrer alltid antistoffer og optimaliser antistoffpanelet før eksperimentet. - Inkuber prøvene ved romtemperatur i 20 min i mørket.
- Tilsett 150 μL FACS Buffer i hver brønn, bland grundig, og gjenta deretter trinn 6.2.
- Gjenta trinn 6.10.
MERK: Utfør ytterligere trinn ved hjelp av alternativ A eller alternativ B. Bruk alternativ A til å farge cellene med overflatemarkører. Bruk alternativ B til å studere de intracellulære markørene etter strømningscytometri.- Trinnene for alternativ A er som følger.
- Resuspend prøvene i 100 μL av 4% paraformaldehyd (PFA) per brønn og inkubere i 20 min ved romtemperatur.
FORSIKTIG: Bruk PFA under panseret. Se sikkerhetsarket for å kassere PFA-avfall/gjenstander som er kommet i kontakt med PFA (f.eks. pipetter) på en sikker måte. - Gjenta trinn 6.2 to ganger.
FORSIKTIG: Ikke kast den ved å flikke inn i vasken her, da den inneholder PFA. Aspirer med pipette og kast avfallet i henhold til sikkerhetsarket. - Resuspend prøvene i 200 μL PBS.
- Overfør prøvene til merkede FACS-rør og fyll på med 100 μL PBS. Hold rørene på is eller i kjøleskap til behandling med FACS-analyse. Hent prøvene på et strømningscytometer innen 24 timer.
- Resuspend prøvene i 100 μL av 4% paraformaldehyd (PFA) per brønn og inkubere i 20 min ved romtemperatur.
- Trinnene for alternativ B er som følger.
- Resuspender prøvene i 100 μL fiksering / permeabiliseringsløsning per brønn (som inneholder paraformaldehyd) og inkuber i 20 minutter ved 4 °C.
FORSIKTIG: Bruk PFA under panseret. Se sikkerhetsarket for å kassere PFA-avfall/gjenstander som er kommet i kontakt med PFA (f.eks. pipetter) på en sikker måte. - Gjenta trinn 6.2.
FORSIKTIG: Ikke kast den ved å flikke inn i vasken her, da den inneholder PFA. Aspirer med pipette og kast avfallet i henhold til sikkerhetsarket. - Tilsett 200 μL 1x permeabilisering / vaskebuffer, bland godt, og gjenta deretter trinn 6.2.
- Gjenta trinn 6.11.2.3.
- Resuspend de faste og permeabiliserte cellene i 50 μL 1x permeabilisering / vaskebuffer som inneholder antistoffer blanding for intracellulær farging.
- Inkuber prøvene ved 4 °C i 30 minutter i mørket.
- Tilsett 200 μL 1x permeabilisering / vaskeløsning, bland godt, og gjenta deretter trinn 6.2.
- Gjenta trinn 6.11.2.7.
- Resuspend prøvene i 200 μL PBS.
- Overfør prøvene til merkede FACS-rør og fyll på med 100 μL PBS. Hold rørene på is eller i kjøleskap til behandling med FACS-analyse. Hent prøvene på et strømningscytometer innen 24 timer.
MERK: Etter å ha utført denne protokollen, er den løvcellefjæringen klar for FACS-analyse. Det anbefales å registrere så mange hendelser som mulig per eksempel. minst 1000-3000 hendelser av en foreldrebefolkning må oppnås for å oppnå pålitelige resultater.
- Resuspender prøvene i 100 μL fiksering / permeabiliseringsløsning per brønn (som inneholder paraformaldehyd) og inkuber i 20 minutter ved 4 °C.
- Trinnene for alternativ A er som følger.
Representative Results
Hovedtrinnene i metoden som er beskrevet for å oppnå en enkelt celle suspensjon av livmor leukocytter er oppsummert i figur 3. Demonstrert i figur 2B er den grunnleggende FACS-gatingstrategien som brukes til identifisering av tre undergrupper av g1 ILCer i B6-mus: uILC1-celler (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) og cNK (CD49a-Eomes+). Videre analyse av disse populasjonene kan utføres for å studere ulike overflate- og intracellulære markører av g1 ILCer. Som et eksempel kan samuttrykket til IFN-ɣ- og selv-MHC-reseptorer vurderes i uILC1-, trNK- og cNK-celler etter stimulering med anti-NK1,1 antistoff (figur 7).
Avhengig av problemstillingen kan både protokollen (figur 3) og antistoffpanelet tilpasses. Det anbefales å bruke både anti-NK1.1 og anti-NKp46 antistoffer i ett FACS-panel for g1 ILC-gating (figur 2B og tabell 1). Det skal bemerkes at g1 ILCer hentet fra blod, milt eller lever har et høyere uttrykk for NKp46 på overflaten enn livmormotparten (figur 8). Overflatefarging for NK1.1 gir bedre separasjon og gjør det enkelt å koble til uterine g1-ILCer (figur 8). Mens NKp46 uttrykkes av alle musestammer, er NKR-P1C-antigenet anerkjent av anti-NK1.1-antistoffet PK136 bare uttrykt av noen musestammer, inkludert C57BL/6 (dvs. B6), FVB/N og NZB, men ikke i AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL eller 129. I tillegg, hvis undersøkeren har til hensikt å studere viktige NK-cellereseptorer som MHC-reseptorene Ly49, er det viktig å være klar over alleliske variasjoner i laboratoriemusstammer, som rekapitulerer den høye variasjonen av humane mordercelleimmunoglobulinlignende reseptorer (KIR). Videre, hvis cellene skal stimuleres med NK1.1 for en funksjonell analyse, som beskrevet i Kim, S. et al.20, kan det være ønskelig å farge cellene med anti-NKp46 i stedet for anti-NK1.1, da NKR-P1C-antigenet kan okkuperes av krysskoblings anti-NK1.1 eller en reseptor downulation kan følge stimuleringen. Enten reseptorbelegg eller downregulering kan hindre farging med samme antistoff som brukes til å stimulere.
Et vanlig problem med enzymatisk vevsdissosiasjon er endringen av overflateepiller på celler av enzymer som brukes til et fordøyelsesmedium. For eksempel er farging for MHC CD94: NKG2A-reseptoren dårlig hvis Liberase TM brukes. Fordøyelsen med Liberase DH bevarer imidlertid NKG2A-anerkjennelse ved 16A11 antistoffklone (figur 9). Det anbefales å sjekke påvirkning av enzymer på alle epitoper i ens FACS-panel. Til dette formål, bruk suspensjon av mus splenocytter oppnådd ved mekanisk dissosiasjon (passerer hele milten gjennom en 70 μm sil). Prøven deles deretter inn i to eller flere deler etterfulgt av inkubasjon med et medium med eller uten enzym(er).
Som nevnt tidligere er blodavledede celler til stede i vevsdissosierte prøver. Om nødvendig kan blodforurensninger utelukkes ved hjelp av en intravaskulær fargingsmetode som utviklet i Masopust laboratory21. Figur 10 viser at rundt 6,5 % av G1 ILC-ene som finnes i livmorvevsprøver på svangerskapsdagen 8,5, er blodavledede. Anti-CD45 antistoffer som brukes til intravaskulær farging kan konjugeres med en fluorokrom som brukes til en dumpkanal; Dette vil utelukke blodforurensninger uten å bruke en ekstra fluorescenskanal. De vanligste problemene og deres løsninger presenteres i tabell 2.
Figur 1: Tverrsnitt av en muse livmor. (A) Mus livmor tverrsnitt (ikke-gravid) som indikerer en rekke mors leukocytter som befolker livmoren. (B) Mus livmor tverrsnitt (svangerskapsdag 8,5). (C) Mus livmor tverrsnitt (svangerskapsdag 13,5). (D) Sammenligning av mus versus human morkakedannelse fra blastocyststadiet og fremover. Bilder opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Subpopulations av livmor g1 ILC1. (A) Prosenter av livmor cNK, ILC1, og trNK hos mus i tidlig liv og graviditet. W - uker, gd - svangerskapsdag. Modifisert graf fra Filipovic, I. et al.4. (B) Gating strategi for å analysere livmor gruppe 1 ILC undergrupper ved flow cytometri. Lymfocytter ble isolert fra livmorvevet på svangerskapsdagen 10,5. Vevsfordøyelse ble utført ved hjelp av et fordøyelsesmedium som inneholder Liberase TM. Celler ble inngjerdet basert på deres evne til å spre lys. Doublets ble utelukket ved hjelp av en FSC-A versus FSC-H-tomt, og bare CD45 + CD3-CD19- levedyktige celler ble analysert videre. I CD45+CD3-CD19- levedyktige celler ble gruppen 1 ILC-port identifisert som NK1.1+ NKp46+-celler. Innenfor gruppe 1 ILCer kan tre delsett identifiseres: CD49a-Eomes+ konvensjonelle NK-celler (cNK), CD49a+Eomes+ vevsresidente NK-celler (trNK) og CD49a+Eomes- uILC1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: En visuell veiledning for hovedtrinnene i protokollen. (1) Disseker den gravide livmoren fri for mesometrial fett. (2) Fjern fostrene; returnere livmoren til 5 ml-røret og hakke vevet. Fortsett med enzymets fordøyelsestrinn: Tilsett 3 ml varm enzymatisk fordøyelsesblanding til hver prøve. Inkuber de 5 ml rørene i 30 min ved 37 °C med agitasjon. (3) (i) Etter fordøyelsen skyller du alt ut av 5 ml rør i 15 ml rør ved hjelp av 10 ml iskald 5 mM EDTA PBS-oppløsning. (ii) Sentrifuge 15 ml rør som inneholder fordøyd vev i 10 min ved 400 x g. (iii) Kast supernatanten; sveip pellet forsiktig og resuspend den i 10 ml varm (37 °C) 5 mM EDTA PBS-oppløsning. (iv) Inkuber prøver i de 15 ml rørene ved 37 °C med agitasjon, i 15 min. (4) Bruk stempelet på en steril 1 ml sprøyte, tving det fordøyde vevet gjennom en 70 μm sil på et riktig merket og sterilt 50 ml rør, og spinn i 10 minutter ved 400 x g. (5) Etter spinnet, fortsett med enten alternativ A (representert her i diagrammer) eller B. Alternativ A: Kast supernatanten fra 50 ml-røret, og bruk en pipetgutt til å resuspendere hver pellets i 8 ml 40% (v / v) isoton percoll i PBS. (6) (i) Alternativ A fortsatte: Bruk en pipet gutt på langsom hastighet, forsiktig overlegg pellet resuspended i 40% Percoll løsning på 5 ml av 80% Percoll løsning. Pipette sakte og kontinuerlig; hold 15 ml-røret i en vinkel på 45°. (ii) Uten å forstyrre overlegget, sentrifugerer du de 15 ml rørene ved 850 x g i 20 minutter ved romtemperatur, med middels akselerasjon og langsom pause. (7) Etter spinnet, mens du prøver å suge en minimumsmengde Percoll-løsning (opptil 4-5 ml totalt), samle forsiktig ringen av leukocytter. (8) Utfør røde blodlegemer lysis trinn. (9) Tell celle ved hjelp av trypan blå og et Neubauer Chamber. (10) Overfør 1-2 millioner celler per brønn til en rundbunns 96-brønnsplate. (11) Fortsett med levedyktighetsfargestoffer og antistofffarging. (12) Til slutt overfører du prøvene til merkede FACS-rør. Hold rørene på is eller i kjøleskap til prosessering med FACS-analyse innen 24 timer. Bilder opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vaginal plugg (A) og fravær av den (B) hos C57BL/6 kvinner ved 0,5 dagers parring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Disseksjon for å trekke ut livmoren fra en gravid mus. (A) Demningen er festet med nåler på et mykt brett for å tørke kroppen med 70% etanol. To vertikale snitt er laget, som angitt av de blå stiplede linjene. (B) Huden løftes for å eksponere indre organer. Tarmløkkene beveges forsiktig opp for å visualisere livmoren. (C) Livmoren prøves ved å kutte på tre punkter: ved siden av eggstokkene og ved livmorhalsen, som angitt av de to blå stiplede linjene og den blå pilen, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fremstilling av encellet suspensjon. (A) Mekanisk fjerning av embryoer fra implantasjonsstedet. (B) Percoll gradient overlegg; Det øverste laget inneholder encellet suspensjon i 40 % av Percoll og det nederste laget 80 % av Percoll. (C) Lymfocyttringdannelse etter sentrifugering av percoll gradient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representativ FACS-analyse av funksjonell analyse med gruppe 1 ILC. Intracellulær IFN-ɣ- og overflate-CD107a-deteksjon i gruppe 1 ILCer som uttrykker NK-reseptorer for selv-MHC (Ly49C, Ly49I og NKG2A) sammenlignet med de som ikke gjør det, etter krysskobling av NK1.1 med platebundne antistoffer. Cellene ble isolert fra livmorvev på svangerskapsdagen 9,5. Vevsfordøyelse ble utført ved hjelp av et fordøyelsesmedium som inneholder Liberase DH. Vist er råverdiene til alle fire kvadranter (hjørner) samt den relative prosentandelen respondere blant celler som uttrykker reseptorer for selv- og respondere som ikke har selvreseptorer (dristige tall). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Farging av miltika og livmor lymfocytter med anti-NKp46 og anti-NK1,1 antistoffer. (A) Celle suspensjoner oppnådd fra mus milt og (B) livmor på svangerskapet dag 10,5 ble skilt i to; den ene delen ble farget med NKp46-APC (rød) og den andre med NK1.1-APC (blå). Vær oppmerksom på at NKp46 farging av livmor lymfocytter ikke skille NKp46 + og NKp46-celler så pent som spleniske lymfocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Reduksjon av NKG2A MFI (antistoffklone: 16A11) ved inkubasjon med fordøyelsesmedium. Celle suspensjon av C56BL / 6 mus splenocytter ble delt inn i tre deler. En del ble inkubert i Liberase DH fordøyelsesmedium (HBSS som inneholder 0,13 WU/ml Liberase DH og 30 μg/ml DNAse), og en annen del ble inkubert med Liberase TM fordøyelsesmedium (HBSS som inneholder 0,52 WU/ml Liberase TM og 30 μg/ml DNAse). Den tredje delen ble behandlet med pent HBSS i 30 min ved 37 °C. Uttrykk for NKG2A-markør på g1 ILCer ble vurdert ved strømningscytometri. Graf hentet fra Shreeve N. Rollen av livmor NK-celle hemming i svangerskapet (Avhandling); Veileder: Colucci F, 2020. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Intravital farging med anti-CD45 antistoffer for utelukkelse av blodavledede g1 ILCer. En C57BL/6 dammus på svangerskapsdagen 8,5 ble kastet 3 min etter intravenøs injeksjon med 3 μg CD45-AF647. Livmoren, hele blodet og thymus ble høstet og behandlet for FACS-analyse. X-aksen viser signalet fra intravenøs farging med CD45-AF647, og Y-aksen demonstrerer signal fra in vitro farget CD45-BUV395. Prosentandelen av delpopulasjoner vises i kvadranter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff / fargestoff | Klon | Fluorokrom | Laser | |
| 1 (dumpkanal) | zombie fiolett fikserbar levedyktighet fargestoff | Fiolett | ||
| CD19 | 1D3 | BV421 | ||
| CD3 | 145-2C11 | BV421 | ||
| 2 | CD45 | 30-F11 | FITC | Blå |
| 3 | NK1.1 | PK136 | BV605 | Fiolett |
| 4 | NKp46 | 29A1.4 | APC | Rød |
| 5 | CD49a | Ha31/8 | BUV395 | Ultrafiolett |
| 6 | EOMER | Dan11mag | PE | Grønn |
Tabell 1: Et eksempel på FACS-panel for konvensjonelle 5-lasere cytometer.
| Problem | Mulig årsak | Forslag |
| Celleringen er ikke synlig ved grensesnittet til to percoll-løsninger | Dårlig lagdeling av percoll-oppløsning eller blanding av to lag under prøvehåndtering | Vær ekstra forsiktig så du ikke brekker percollputen på 80 % under overlegg. Vær oppmerksom under prøvehåndtering: Ikke forstyrr percoll-grensesnittet |
| Lavt antall leukocytter (for eksempel når du bruker en ikke-gravid livmor) | Grensesnittet kan ses selv når cellenummeret på grensesnittet er svært lavt. Selv om ringen ikke er synlig, samle væske på mellom 40% og 80% percoll løsninger, da det fortsatt kan være nok celler for videre behandling | |
| Ufullstendig RBC lysis | Celler ble ikke resuspendert riktig i lysingsbufferen | Pipetteceller opp og ned for å bryte klumpene og fullstendig resuspend celler i lysing buffer |
| Lysingsløsningen er kald | Likevekt lysingsløsningen til romtemperatur før bruk | |
| Forlenge inkubasjonstiden med lysingsløsningen opptil 15min | ||
| RBC lysis trinn kan gjentas | ||
| Lavt celleutbytte | Dårlig enzymatisk fordøyelse | Sjekk om enzymer ikke er utdaterte og har blitt lagret i henhold til deres manualer |
| Celletap under vasketrinn | Inspiser cellepellet etter hvert vasketrinn: den ugjennomsiktige pelletsen nederst i brønnen etter spinn. Ved å bruke V-bunn i stedet U-bunnplater, svingrotor sentrifuge, lengre sentrifugeringstid kan redusere celletap | |
| Vevsprøve inneholder lavt antall lymfocytter (for eksempel når du bruker en ikke-gravid livmor) | Pool flere livmorer for å oppnå nok hendelser for analyse. Vurder å bruke alternativ B i protokollen for celleisolasjon | |
| Høy variasjon av absolutte leukocytttall hentet fra mus av samme gruppe | Inkonsekvent samling av celler ved grensesnittet til 40% og 80% percoll-løsninger | Sørg for å samle hele cellefraksjonen på percoll-grensesnittet. Vurder å bruke alternativ B i protokollen for celleisolasjon |
| Ikke i stand til å oppdage forventede lymfocytt subpopulations / markører eller uvanlig lav MFI for noen celle overflatemarkører | Enzymatisk fordøyelse påvirker overflateuttrykket til noen epitoper eller deres nedbrytning | Optimaliser enzymatisk fordøyelse ved å endre: enzym (f.eks. til forskjellige typer liberase eller kollagenase) og/eller lengden på inkubasjon og/eller enzymkonsentrasjon |
| Høy bakgrunnsstøy i strømningscytometeret | Høy andel cellerester eller RBC-forurensning | Juster parameteren for FSC-terskelverdi. Vurder å bruke alternativ A i protokollen for celleisolasjon |
Tabell 2: Veiledning for feilsøking.
Discussion
Metoden inneholder flere kritiske trinn som er diskutert heretter. Det første kritiske trinnet er å oppnå flere synkrone graviditeter som den relative frekvensen av leukocyttpopulasjoner endres gjennom graviditet. Å ha flere demninger på samme svangerskapsdag tillater enten biologiske repetisjoner i de samme forsøkene eller sammenslåing av lymfocytter fra individuelle dammer for å oppnå større antall som kreves for nedstrøms applikasjoner. Tidsbetimet parring gjør det mulig for forskeren å finne unnfangelse innen en 24 timers periode. Selv om mus lever i rundt 2,5 år, vil de være av reproduktiv alder fra 4-7 uker til 6-8 måneder. Ettersom yngre mus vanligvis produserer mindre valper, blir kvinnelige mus generelt ikke parret før de er mellom 6-8 uker, og mannlige mus til de er mellom 8-10 uker. Gitt at østrus varer ca 15 h hos mus og forekommer hver 4-5 dager, er den typiske parringsraten (avslørt av en vaginal plugg, se figur 4) rundt 25%. Det er derfor viktig å bruke mus i østrus og planlegge tilstrekkelig antall for å oppnå det nødvendige antall dammer for et gitt eksperiment. Østrus syklus fase kan bestemmes av vaginal smør cytologi22. Plugghastigheten kan forbedres ved å hvile menn 48 timer før parring og ved å dra nytte av Whitten-effekten18. Alternativt kan man administrere gravid mare serum, som etterligner effekten av den endogene follikkelstimulerende hormonet, indusere oocytt modning og, 42-50 h senere, menneskelig chorionic gonadotropin, som etterligner effekten av den endogene luteiniserende hormon, induserende eggløsning. Denne hormonelle behandlingen omgår kravet til østrus og gjør nesten alle behandlede kvinner mottakelige.
Et annet kritisk skritt er å sikre kvaliteten på FACS-fargingen. Antistoffer som brukes i strømningscytometri må alltid titreres og brukes ved optimal konsentrasjon, og det er nødvendig å kontrollere at den enzymatiske fordøyelsen ikke cleave avgjørende antigene epitoper. For å vurdere om et enzym vil spalte en epitop, kan man flekke to brøkdeler av samme prøve parallelt, den ene gjennomgår enzymatisk og den andre mekaniske fordøyelsen. På samme måte er bruk av passende kontroller og enkeltflekker avgjørende for å oppnå pålitelige data. For sjeldne hendelser kan perler brukes til å generere enkeltflekkprøver. Det anbefales ikke å bruke perler for å sette opp spenninger, men snarere en populasjon av celler som inneholder lymfocytter og andre leukocytter, for eksempel splenocytter. Hvis perler brukes, er det nødvendig å titrate antistoffer for perlefarging, slik at fluorescensintensiteten til fargede perler vil være sammenlignbar med fluorescensintensiteten til celler. Ved vanskeligheter med å skille positivt fra negative celler for en bestemt markør, kan en FMO-kontroll også brukes til å lette gatingen for en bestemt markør. Når det gjelder intracellulære markører, må en isotypekontroll brukes som intracellulær farging kan føre til gjenværende ubundne antistoffer, som fortsatt kan være til stede i celler etter vasketrinnene og dermed øke bakgrunnssignalet. Det anbefales å kjøre prøvene innen 24 timer etter å ha fikset cellene for å oppnå de beste resultatene i fenotyping ved FACS-analyse, da autofluorescens øker betydelig over tid, og fluorescensintensiteten til noen antistoffer kan avta over tid.
En annen avgjørende faktor å vurdere er nedstrøms anvendelsen av encellet suspensjon oppnådd med protokollen. For funksjonelle analyser er det viktig å jobbe i sterile forhold. På samme måte, for etterfølgende omics-studier, er det viktig å jobbe i steril og RNase, DNase og proteasefri.
Protokollen som presenteres her fokuserer på fenotyping gruppe 1 ILCer, men kan tilpasses for fenotyping av andre celletyper ved å modifisere antistoffpanelet. Det anbefales at alle antistoffer testes mot fordøyd og ikke-fordøyd cellefjæring for å oppdage tap /endring av overflateepiller ved enzymatisk behandling. På samme måte kan forskjellige enzymer brukes til å fordøye vevet og øke celleutbyttet, men effekten på viktige antigene epitoper må studeres nøye. Mens NKp46 er en god markør for spleniske NK-celler og fungerer i alle stammer av laboratoriemus, er uttrykket av NKp46 på uNK-celler i C57BL / 6 mus betydelig lavere enn på milt NK-celler. Det er best å flekke for både NK1.1 og NKp46 samtidig. Hvis flere organer skal sammenlignes direkte, anbefales det å behandle alle prøver likt, selv om den enzymatiske fordøyelsen ikke er nødvendig for vev som milten eller benmargen. Selv om metoden som presenteres her gjelder for den ikke-gravide livmoren, vil lymfocyttringens isolasjon av en tofaset Percoll-gradient være utfordrende, og utbyttet av isolerte celler kan være for lavt for pålitelig FACS-analyse og vil derfor kreve å samle celler isolert fra livmoren til individuelle, ikke-gravide mus23.
Det er begrensninger i protokollen å vurdere for tolkningen av dataene. Som det er tilfelle for alle vev, vil sirkulerende lymfocytter som kommer fra blodet bli isolert sammen med vevsboende celler. Hvis utelukkelse av sirkulerende lymfocytter er avgjørende for datatolkning, kan intravital farging utføres for å merke sirkulerende celler. Videre er en annen begrensning i protokollen at noen celler vil gå tapt, da ikke alle celler kan trekkes ut av vevet. De vanligste problemene og feilsøkingen vises i tabell 2.
Historisk har studiet av celler i vev stolt på histologisk undersøkelse av vevsseksjoner. Sandra Peels utmerkede gjennomgang24 oppsummerer arbeidet som er gjort over mer enn 100 år frem til slutten av 80-tallet. Beskrivelser av celler senere kjent som uNK-celler vises faktisk i manuskripter publisert mer enn et halvt århundre før lymfocytter til og med ble oppdaget. Så, før oppdagelsen av NK-celler i 1975, og uNK-cellene har blitt indikert som mors glykogenceller eller granulerte metriale kjertelceller. Anne Croy har gjort store bidrag på feltet25 og har lært teamet disseksjonen hun hadde optimalisert3, og som brukes for tiden. Selv om det er medvirkende til å beskrive morfologien og vevsplasseringen til uNK-celler, er klassisk histologisk undersøkelse begrenset til påvisning av bare noen få markører på cellene av interesse. I 2008 ble en strømningscytometribasert metode for samtidig å oppdage flere markører på livmorlymfocytter beskrevet26. Dette er egentlig metoden som er beskrevet i dette dokumentet. Nyere teknologier som romlig transkripsjon og avbildning ved massecytometri kombinerer kraften i histologi og strømningscytometri, slik at både samtidig deteksjon av flere gener eller proteiner, henholdsvis, og bevaring av den normale vevsarkitekturen.
Anvendelsen av metoden som er beskrevet her er flere og inkluderer FACS-fenotyping, funksjonell analyse (for eksempel ELISPOT, deriangulering eller cytotoksiske analyser), cellesortering og påfølgende transkripsjons- eller proteomikk. Videre applikasjoner som kan utvikles basert på denne metoden inkluderer kultur og utvidelse av løvfisk NK-celler etter cellesortering eller berikelse ved negativ uttømming. For tiden er det ingen protokoll til kultur og utvide musen uNK celler og bevare deres levedyktighet og funksjonalitet for en lengre periode, på samme måte som menneskelige NK celler som kan dyrkes og utvides i 7-14 dager ved tillegg av IL-2 eller en kombinasjon IL-12 og IL-15. Optimalisering av en slik metode for muse-uNK-celler vil gi mer fleksibilitet når du utfører funksjonelle analyser og tillater at flere forhold testes med et høyere cellenummer. På den annen side er kulturforhold kjent for å endre den unike fenotypen av lymfocytter og potensielt deres funksjon også.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre og ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker de forrige og nåværende teammedlemmene som har bidratt til å utvikle denne metoden, inkludert Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic og Anita Qualls. Denne forskningen ble finansiert av Wellcome trust [Grant number 200841/Z/16/Z ] og Medical Research Council (MR/P001092/1). Med det formål å åpne tilgangen, har forfatteren brukt en CC BY offentlig opphavsrettslisens til enhver forfatter akseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| CD19 antibody | BD | 562701 | |
| CD3 antibody | BD | 562600 | |
| CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
| CD49a antibody | BD | 740262 | |
| DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
| EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
| Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
| Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
| Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
| Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
| NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
| NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
| Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
| PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
| PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
| Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
| RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
| Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |
References
- Colucci, F.
- Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
- Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , Elsevier, Academic Press. (2014).
- Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).
- Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).
- Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
- Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).
- Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M.
- Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
- Crespo, ÂC., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
- Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
- Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
- Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).
- Vander lee, S., Boot, L. M.
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Caligioni, C. S.
- Doisne, J. -M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).
- Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, Springer. Berlin. (1989).
- Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
- Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).
