Оптимизированная система O9-1/Hydrogel для изучения механических сигналов в клетках нервного гребня
Summary
Здесь описаны подробные пошаговые протоколы изучения механических сигналов in vitro с использованием мультипотентных клеток нервного гребня O9-1 и полиакриламидных гидрогелей различной жесткости.
Abstract
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой эмбриональные мультипотентные клетки позвоночных, которые могут мигрировать и дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, которые дают начало различным органам и тканям. Жесткость тканей производит механическую силу, физический сигнал, который играет решающую роль в дифференцировке NCC; однако механизм остается неясным. Способ, описанный здесь, предоставляет подробную информацию для оптимизированной генерации полиакриламидных гидрогелей различной жесткости, точного измерения такой жесткости и оценки воздействия механических сигналов в клетках O9-1, линии NCC, которая имитирует NCC in vivo NCC.
Жесткость гидрогеля измеряли с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM) и соответственно указывали на различные уровни жесткости. O9-1 NCC, культивируемые на гидрогелях различной жесткости, показали различную морфологию клеток и экспрессию генов стрессовых волокон, что указывало на различные биологические эффекты, вызванные изменениями механического сигнала. Кроме того, было установлено, что изменение жесткости гидрогеля привело к созданию эффективной системы in vitro для манипулирования механической сигнализацией путем изменения жесткости геля и анализа молекулярно-генетической регуляции в NCC. NCC O9-1 могут дифференцироваться в широкий спектр типов клеток под воздействием соответствующих дифференцирующих сред, и удобно манипулировать химическими сигналами in vitro. Таким образом, эта система in vitro является мощным инструментом для изучения роли механической сигнализации в NCC и ее взаимодействия с химическими сигналами, что поможет исследователям лучше понять молекулярно-генетические механизмы развития нервного гребня и заболеваний.
Introduction
Клетки нервных гребней (NCC) представляют собой группу стволовых клеток во время эмбриогенеза позвоночных с замечательной способностью мигрировать и способствовать развитию различных органов и тканей. NCC могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая сенсорные нейроны, хрящи, кости, меланоциты и гладкомышечные клетки, в зависимости от местоположения осевого происхождения и местного экологического руководства NCC1,2. Обладая способностью дифференцироваться в широкий спектр типов клеток, генетические аномалии, вызывающие дисрегуляцию на любой стадии развития нервного гребня (НК), могут привести к многочисленным врожденным заболеваниям2. Например, возмущения во время формирования, миграции и развития NCC приводят к нарушениям развития, известным в совокупности как нейрокристопатии1,3. Эти заболевания варьируются от черепно-лицевых дефектов из-за сбоя в образовании NCC, таких как синдром Тричера Коллинза, до развития различных видов рака из-за метастатической мигрирующей способности NCC, как видно при меланоме3,4,5,6. За последние несколько десятилетий исследователи сделали замечательные открытия о роли и механизмах NCC в развитии и заболеваниях, причем большинство результатов сосредоточены на химических сигналах7,8. Совсем недавно было указано, что механические сигналы играют решающую, но плохо понятную роль в разработке NCC9,10.
Экологические сигналы NCC играют решающую роль во время их развития, включая регулирование дифференцировки NCC в различные типы клеток. Сигналы окружающей среды, например, физические сигналы, влияют на ключевое поведение и клеточные реакции, такие как функциональная диверсификация. Механотрансдукция позволяет клеткам ощущать и реагировать на эти сигналы для поддержания различных биологических процессов2. NCC окружены соседними клетками и различными субстратами, такими как внеклеточный матрикс (ECM), который может давать начало механическим стимулам для поддержания гомеостаза и адаптации к изменениям посредством определения судьбы, пролиферации и апоптоза11. Механотрансдукция начинается на плазматической мембране, где происходит сенсорный компонент механических внеклеточных раздражителей, в результате чего происходит внутриклеточная регуляция клетки12. Интегрины, фокальные спайки и соединения плазматической мембраны ретранслируют механические сигналы, такие как силы сдвига, напряжение и жесткость окружающих субстратов, в химические сигналы для получения клеточных реакций12. Ретрансляция химических сигналов от плазматической мембраны к конечной клеточной регуляции осуществляется через различные сигнальные пути для завершения жизненно важных для организма процессов, таких как дифференцировка.
Несколько исследований показали, что механическая сигнализация от жесткости субстрата играет роль в дифференцировке клеток13,14. Например, предыдущие исследования показали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выращенные на мягких субстратах с жесткостью, аналогичной жесткости ткани мозга (в диапазоне 0,1-1,0 кПа), приводили к дифференцировке нейрональных клеток15,16. Однако больше МСК дифференцируются в миоцитоподобные клетки при выращивании на субстратах 8-17 кПа, имитирующих жесткость мышц, в то время как остеобластная дифференцировка наблюдалась при культивировании МСК на жестких субстратах (25-40 кПа)15,16. Значение механотрансдукции подчеркивается нарушениями и аномалиями в механическом сигнальном пути, которые потенциально приводят к тяжелым дефектам развития и заболеваниям, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и остеопороз17,18,19. При раке нормальная ткань молочной железы мягкая, и риск рака молочной железы увеличивается в жесткой и плотной ткани молочной железы, среда, которая больше похожа на опухоли молочной железы15. Обладая этими знаниями, влияние механической сигнализации на развитие NCC может быть изучено путем простого манипулирования жесткостью субстрата через систему in vitro, обеспечивая дополнительные преимущества и возможности в понимании основ прогрессирования и этиологии заболеваний, связанных с NC.
Для изучения влияния механических сигналов в НКЦ создана эффективная система in vitro для ННК, основанная на оптимизации ранее опубликованных методов и оценке реакций НКЦ на различные механические сигналы20,21. Был разработан подробный протокол для получения различной жесткости гидрогеля и оценки воздействия механической сигнализации в НКЦ. Для достижения этой цели NCC O9-1 используются в качестве модели NC для изучения эффектов и изменений в ответ на жесткие и мягкие гидрогели. O9-1 NCC представляют собой стабильную клеточную линию NC, выделенную из эмбриона мыши (E) в день 8,5. O9-1 NCC имитируют NCC in vivo, потому что они могут дифференцироваться в различные типы клеток, полученных из NC, в определенных дифференцировочных средах22. Для изучения механической сигнализации ННК изготавливали матричную подложку с перестраиваемой эластичностью из изменяющихся концентраций растворов акриламида и бис-акриламида для достижения желаемой жесткости, коррелирующей с жесткостью биологического субстрата20,21,23. Для оптимизации условий матричной субстрата для NCC, в частности O9-1 клеток, были сделаны модификации из ранее опубликованного протокола20. Одно из изменений, внесенных в этот протокол, заключалось в инкубации гидрогелей в коллагене I, разбавленном в 0,2% уксусной кислоты вместо 50 мМ HEPES, при 37 °C в течение ночи. Низкий рН уксусной кислоты приводит к однородному распределению и более высокому включению коллагена I, что позволяет более равномерно присоединять белок ECM24. Кроме того, комбинацию конской сыворотки и фетальной бычьей сыворотки (FBS) использовали в концентрациях 10% и 5% в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) соответственно перед хранением гидрогелей в инкубаторе. Конская сыворотка использовалась в качестве дополнительной добавки к FBS из-за ее способности способствовать пролиферации и дифференцировке клеток в концентрации 10%25.
С помощью этого метода биологическая среда была имитирована белковым покрытием ECM (например, коллагеном I), чтобы создать точную среду in vitro для NCC, чтобы расти и выживать20,21. Жесткость подготовленных гидрогелей была количественно проанализирована с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM), хорошо известного метода для изображения модуля упругости26. Чтобы изучить влияние различных уровней жесткости на NCC, клетки дикого типа O9-1 культивировали и готовили на гидрогелях для окрашивания иммунофлуоресценцией (IF) против нитевидного актина (F-актина), чтобы показать различия в адгезии и морфологии клеток в ответ на изменения жесткости субстрата. Используя эту систему in vitro, исследователи смогут изучить роль механической сигнализации в NCC и ее взаимодействие с другими химическими сигналами, чтобы получить более глубокое понимание взаимосвязи между NCC и механической сигнализацией.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью текущего исследования является обеспечение эффективной и действенной системы in vitro для лучшего понимания воздействия механических сигналов в NCC. В дополнение к следу пошаговому протоколу, упомянутому выше, исследователи должны иметь в виду, что клеточная культура NCC O9-1 зави?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Ана-Марию Заске, оператора установки Atomic Force Microscope-UT Core в Центре медицинских наук Техасского университета, за вклад в AFM в этом проекте. Мы также благодарим источники финансирования от Национальных институтов здравоохранения (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 и R01HL142704 J. Wang).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
Riferimenti
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Biologia dello sviluppo. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
