Un système O9-1/Hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de la crête neurale
Summary
Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.
Abstract
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules embryonnaires multipotentes vertébrées qui peuvent migrer et se différencier en un large éventail de types de cellules qui donnent naissance à divers organes et tissus. La rigidité des tissus produit une force mécanique, un indice physique qui joue un rôle essentiel dans la différenciation des CNC; toutefois, le mécanisme reste flou. La méthode décrite ici fournit des informations détaillées pour la génération optimisée d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, la mesure précise de cette rigidité et l’évaluation de l’impact des signaux mécaniques dans les cellules O9-1, une ligne NCC qui imite les CCN in vivo.
La rigidité de l’hydrogel a été mesurée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) et a indiqué différents niveaux de rigidité en conséquence. Les CCN O9-1 cultivés sur des hydrogels de rigidité variable ont montré une morphologie cellulaire et une expression génique différentes des fibres de stress, ce qui indiquait des effets biologiques variables causés par des changements de signal mécaniques. De plus, cela a établi que la variation de la rigidité de l’hydrogel a abouti à un système in vitro efficace pour manipuler la signalisation mécanique en modifiant la rigidité du gel et en analysant la régulation moléculaire et génétique dans les CCN. Les NCC O9-1 peuvent se différencier en un large éventail de types de cellules sous l’influence des milieux de différenciation correspondants, et il est pratique de manipuler les signaux chimiques in vitro. Par conséquent, ce système in vitro est un outil puissant pour étudier le rôle de la signalisation mécanique dans les CCN et son interaction avec les signaux chimiques, ce qui aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et génétiques du développement de la crête neurale et des maladies.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont un groupe de cellules souches au cours de l’embryogenèse des vertébrés avec une capacité remarquable à migrer et à contribuer au développement de divers organes et tissus. Les CCN peuvent se différencier en différents types de cellules, y compris les neurones sensoriels, le cartilage, les os, les mélanocytes et les cellules musculaires lisses, en fonction de l’emplacement de l’origine axiale et du guidage environnemental local du CNC1,2. Avec la capacité de se différencier en un large éventail de types cellulaires, les anomalies génétiques qui provoquent un dérèglement à n’importe quel stade du développement de la crête neurale (NC) peuvent conduire à de nombreuses maladies congénitales2. Par exemple, les perturbations au cours de la formation, de la migration et du développement des CCN entraînent des troubles du développement connus collectivement sous le nom de neurocristopathies1,3. Ces maladies vont des défauts craniofaciaux dus à l’échec de la formation des CNC, tels que le syndrome de Treacher Collins, au développement de divers cancers dus à la capacité migratoire métastatique des CNC, comme on le voit dans le mélanome3,4,5,6. Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont fait des découvertes remarquables sur les rôles et les mécanismes des CCN dans le développement et les maladies, la majorité des résultats étant axés sur les signaux chimiques7,8. Plus récemment, il a été indiqué que les signaux mécaniques jouaient un rôle critique mais mal compris dans le développement de laCCN 9,10.
Les signaux environnementaux des CCN jouent un rôle essentiel au cours de leur développement, y compris la régulation de la différenciation des CNC en différents types de cellules. Les indices environnementaux, par exemple les indices physiques, influencent les comportements pivots et les réponses cellulaires, telles que la diversification fonctionnelle. La mécanotransduction permet aux cellules de détecter et de répondre à ces signaux pour maintenir divers processus biologiques2. Les CCN sont entourés de cellules voisines et de différents substrats, tels que la matrice extracellulaire (ECM), qui peuvent donner lieu à des stimuli mécaniques pour maintenir l’homéostasie et s’adapter aux changements par la détermination du destin, la prolifération et l’apoptose11. La mécanotransduction commence au niveau de la membrane plasmique où se produit la composante sensorielle des stimuli extracellulaires mécaniques, entraînant la régulation intracellulaire de la cellule12. Les intégrines, les adhérences focales et les jonctions de la membrane plasmique relaient les signaux mécaniques, tels que les forces de cisaillement, les contraintes et la rigidité des substrats environnants, en signaux chimiques pour produire des réponses cellulaires12. Le relais des signaux chimiques de la membrane plasmique à la régulation cellulaire finale est effectué via différentes voies de signalisation pour finaliser les processus vitaux pour l’organisme, tels que la différenciation.
Plusieurs études ont suggéré que la signalisation mécanique de la rigidité du substrat joue un rôle dans la différenciation cellulaire13,14. Par exemple, des études antérieures ont montré que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur des substrats mous avec une rigidité similaire à celle du tissu cérébral (de l’ordre de 0,1 à 1,0 kPa) entraînaient une différenciation des cellules neuronales15,16. Cependant, plus de CSM se différencient en cellules de type myocytaire lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats de 8 à 17 kPa imitant la rigidité du muscle, tandis qu’une différenciation de type ostéoblaste a été observée lorsque les CSM ont été cultivés sur des substrats rigides (25-40 kPa)15,16. L’importance de la mécanotransduction est mise en évidence par les irrégularités et les anomalies dans la voie de signalisation mécanique qui conduisent potentiellement à de graves défauts de développement et des maladies, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires et l’ostéoporose17,18,19. Dans les cancers, le tissu mammaire normal est mou et le risque de cancer du sein augmente dans le tissu mammaire raide et dense, un environnement qui s’apparente davantage à des tumeurs mammaires15. Grâce à ces connaissances, les effets de la signalisation mécanique sur le développement de la CCN peuvent être étudiés par une simple manipulation de la rigidité du substrat à travers un système in vitro, offrant ainsi d’autres avantages et possibilités pour comprendre les principes fondamentaux de la progression et de l’étiologie de la maladie liée à la NC.
Pour étudier l’impact des signaux mécaniques dans les CCN, nous avons établi un système in vitro efficace pour les CCN basé sur l’optimisation des méthodes précédemment publiées et l’évaluation des réponses des CCN à différents signaux mécaniques20,21. Un protocole détaillé a été fourni pour la préparation de la rigidité variable de l’hydrogel et l’évaluation de l’impact de la signalisation mécanique dans les CCN. Pour ce faire, les CCN O9-1 sont utilisés comme modèle CN pour étudier les effets et les changements en réponse aux hydrogels rigides par rapport aux hydrogels mous. Les NCC O9-1 sont une lignée cellulaire NC stable isolée à partir d’embryons de souris (E) au jour 8,5. Les NCC O9-1 imitent les NCC in vivo parce qu’ils peuvent se différencier en différents types de cellules dérivées de NC dans des milieux de différenciation définis22. Pour étudier la signalisation mécanique des CCN, un substrat matriciel a été fabriqué avec une élasticité accordable à partir de concentrations variables de solutions d’acrylamide et de bis-acrylamide pour obtenir la rigidité souhaitée, en corrélation avec la rigidité biologique du substrat20,21,23. Afin d’optimiser les conditions du substrat matriciel pour les CCN, en particulier les cellules O9-1, des modifications ont été apportées à partir du protocole20précédemment publié. Un changement apporté à ce protocole a été d’incuber des hydrogels dans du collagène I, dilués dans de l’acide acétique à 0,2 % au lieu de 50 mM d’HEPES, à 37 °C pendant la nuit. Le faible pH de l’acide acétique conduit à une distribution homogène et à une incorporation plus élevée de collagène I, permettant ainsi une fixation plus uniforme de la protéine ECM24. En outre, une combinaison de sérum de cheval et de sérum fœtal bovin (FBS) a été utilisée à des concentrations de 10% et 5% dans une solution saline tampon phosphate (PBS), respectivement, avant de stocker les hydrogels dans l’incubateur. Le sérum de cheval a été utilisé comme supplément supplémentaire au FBS en raison de sa capacité à favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires à la concentration de 10%25.
Avec cette méthode, un environnement biologique a été imité par le revêtement protéique ECM (par exemple, le collagène I) pour créer un environnement in vitro précis permettant aux CCN de croître et de survivre20,21. La rigidité des hydrogels préparés a été analysée quantitativement par microscopie à force atomique (AFM), une technique bien connue pour représenter le module élastique26. Pour étudier l’effet de différents niveaux de rigidité sur les CCN, des cellules O9-1 de type sauvage ont été cultivées et préparées sur des hydrogels pour la coloration par immunofluorescence (FI) contre l’actine filamenteuse (F-actine) afin de montrer les différences d’adhésion cellulaire et de morphologies en réponse aux changements de rigidité du substrat. En utilisant ce système in vitro, les chercheurs seront en mesure d’étudier les rôles de la signalisation mécanique dans les NCC et son interaction avec d’autres signaux chimiques afin de mieux comprendre la relation entre les NCC et la signalisation mécanique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de la présente étude est de fournir un système in vitro efficace et efficient pour mieux comprendre l’impact des signaux mécaniques dans les CCN. En plus de suivre le protocole étape par étape mentionné ci-dessus, les chercheurs doivent garder à l’esprit que la culture cellulaire des CCN O9-1 est affectée par le type de couvercles en verre utilisés pour préparer les hydrogels. Par exemple, il a été noté que les cellules ensemencées sur un type spécifique de couvercle en verre (vo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Dre Ana-Maria Zaske, opératrice de l’installation Atomic Force Microscope-UT Core au Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas, pour l’expertise apportée en AFM dans ce projet. Nous remercions également J. Wang les sources de financement des National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 et R01HL142704).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
Riferimenti
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