Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural
Summary
Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.
Abstract
Las células de la cresta neural (NCC) son células multipotentes embrionarias de vertebrados que pueden migrar y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células que dan lugar a diversos órganos y tejidos. La rigidez tisular produce fuerza mecánica, una señal física que juega un papel crítico en la diferenciación de NCC; sin embargo, el mecanismo sigue sin estar claro. El método descrito aquí proporciona información detallada para la generación optimizada de hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable, la medición precisa de dicha rigidez y la evaluación del impacto de las señales mecánicas en las células de O9-1, una línea NCC que imita a los NCC in vivo.
La rigidez del hidrogel se midió mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) e indicó diferentes niveles de rigidez en consecuencia. Los NCC de O9-1 cultivados en hidrogeles de rigidez variable mostraron una morfología celular y una expresión génica diferentes de las fibras de estrés, lo que indicó efectos biológicos variables causados por cambios en las señales mecánicas. Además, esto estableció que la variación de la rigidez del hidrogel dio como resultado un sistema in vitro eficiente para manipular la señalización mecánica alterando la rigidez del gel y analizando la regulación molecular y genética en nccs. O9-1 NCCs pueden diferenciarse en una amplia gama de tipos de células bajo la influencia de los medios de diferenciación correspondientes, y es conveniente manipular señales químicas in vitro. Por lo tanto, este sistema in vitro es una herramienta poderosa para estudiar el papel de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con las señales químicas, lo que ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos moleculares y genéticos del desarrollo de la cresta neural y las enfermedades.
Introduction
Las células de la cresta neural (NCC) son un grupo de células madre durante la embriogénesis de vertebrados con una notable capacidad para migrar y contribuir al desarrollo de diversos órganos y tejidos. Los NCC pueden diferenciarse en diferentes tipos de células, incluidas las neuronas sensoriales, el cartílago, el hueso, los melanocitos y las células del músculo liso, dependiendo de la ubicación del origen axial y la orientación ambiental local del NCC1,2. Con la capacidad de diferenciarse en una amplia gama de tipos de células, las anomalías genéticas que causan desregulación en cualquier etapa del desarrollo de la cresta neural (NC) pueden conducir a numerosas enfermedades congénitas2. Por ejemplo, las perturbaciones durante la formación, migración y desarrollo de las NCC conducen a trastornos del desarrollo conocidos colectivamente como neurocristopatías1,3. Estas enfermedades van desde defectos craneofaciales debido a fallas en la formación de NCC, como el síndrome de Treacher Collins, hasta el desarrollo de varios cánceres debido a la capacidad migratoria metastásica de NCC, como se ve en el melanoma3,4,5,6. En las últimas décadas, los investigadores han hecho descubrimientos notables sobre los roles y mecanismos de los NCC en el desarrollo y las enfermedades, y la mayoría de los hallazgos se centran en las señales químicas7,8. Más recientemente, se ha indicado que las señales mecánicas desempeñan un papel crítico pero poco comprendido en el desarrollo de NCC9,10.
Las señales ambientales de los NCC juegan un papel crítico durante su desarrollo, incluida la regulación de la diferenciación de NCC en varios tipos de células. Las señales ambientales, por ejemplo, las señales físicas, influyen en los comportamientos fundamentales y las respuestas celulares, como la diversificación funcional. La mecanotransducción permite a las células detectar y responder a esas señales para mantener diversos procesos biológicos2. Los NCC están rodeados de células vecinas y diferentes sustratos, como la matriz extracelular (ECM), que puede dar lugar a estímulos mecánicos para mantener la homeostasis y adaptarse a los cambios a través de la determinación del destino, la proliferación y la apoptosis11. La mecanotransducción comienza en la membrana plasmática donde se produce el componente sensorial de los estímulos mecánicos extracelulares, dando lugar a la regulación intracelular de la célula12. Las integrinas, las adherencias focales y las uniones de la membrana plasmática transmiten señales mecánicas, como las fuerzas de cizallamiento, la tensión y la rigidez de los sustratos circundantes, en señales químicas para producir respuestas celulares12. La retransmisión de señales químicas desde la membrana plasmática hasta la regulación celular final se lleva a cabo a través de diferentes vías de señalización para finalizar procesos vitales para el organismo, como la diferenciación.
Varios estudios han sugerido que la señalización mecánica de la rigidez del sustrato juega un papel en la diferenciación celular13,14. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las células madre mesenquimales (MSC) cultivadas en sustratos blandos con una rigidez similar a la del tejido cerebral (en el rango de 0.1-1.0 kPa) resultaron en la diferenciación de células neuronales15,16. Sin embargo, más MSC se diferencian en células similares a los miocitos cuando se cultivan en sustratos de 8-17 kPa que imitan la rigidez del músculo, mientras que la diferenciación similar a los osteoblastos se observó cuando las MSC se cultivaron en sustratos rígidos (25-40 kPa)15,16. La importancia de la mecanotransducción se destaca por las irregularidades y anomalías en la vía de señalización mecánica que potencialmente conducen a defectos y enfermedades graves del desarrollo, incluidos el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la osteoporosis17,18,19. En los cánceres, el tejido mamario normal es blando, y el riesgo de cáncer de mama aumenta en el tejido mamario rígido y denso, un ambiente que es más parecido a los tumores de mama15. Con este conocimiento, los efectos de la señalización mecánica en el desarrollo de NCC se pueden estudiar a través de la manipulación simple de la rigidez del sustrato a través de un sistema in vitro, proporcionando más ventajas y posibilidades para comprender los fundamentos de la progresión y etiología de la enfermedad relacionada con NC.
Para estudiar el impacto de las señales mecánicas en los NCC, establecimos un sistema in vitro eficiente para ncCs basado en la optimización de métodos previamente publicados y la evaluación de las respuestas de los NCCs a diferentes señales mecánicas20,21. Se proporcionó un protocolo detallado para la preparación de la rigidez variable del hidrogel y la evaluación del impacto de la señalización mecánica en los NCC. Para lograr esto, los NCC O9-1 se utilizan como modelo NC para estudiar los efectos y cambios en la respuesta a los hidrogeles rígidos frente a los blandos. Los NCC O9-1 son una línea celular NC estable aislada del embrión de ratón (E) en el día 8.5. Los NCC de O9-1 imitan a los NCC in vivo porque pueden diferenciarse en varios tipos de células derivadas de NC en medios de diferenciación definidos22. Para estudiar la señalización mecánica de los NCC, se fabricó un sustrato de matriz con elasticidad sintonizable a partir de concentraciones variables de soluciones de acrilamida y bisacrilamida para lograr la rigidez deseada, correlacionándose con la rigidez biológica del sustrato20,21,23. Para optimizar las condiciones de sustrato matricial para NCCs, específicamente células O9-1, se realizaron modificaciones a partir del protocolo20previamente publicado. Un cambio realizado en este protocolo fue incubar hidrogeles en colágeno I, diluidos en ácido acético al 0,2% en lugar de 50 mM HEPES, a 37 °C durante la noche. El bajo pH del ácido acético conduce a una distribución homogénea y una mayor incorporación de colágeno I, lo que permite una unión más uniforme de la proteína ECM24. Además, se utilizó una combinación de suero de caballo y suero fetal bovino (FBS) en las concentraciones de 10% y 5% en solución salina tampón de fosfato (PBS), respectivamente, antes de almacenar los hidrogeles en la incubadora. El suero de caballo se utilizó como un suplemento adicional a FBS debido a su capacidad para promover la proliferación y diferenciación celular a la concentración de 10%25.
Con este método, un entorno biológico fue imitado por el recubrimiento de proteína ECM (por ejemplo, colágeno I) para crear un entorno in vitro preciso para que los NCC crezcan y sobrevivan20,21. La rigidez de los hidrogeles preparados se analizó cuantitativamente mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), una técnica bien conocida para representar el módulo elástico26. Para estudiar el efecto de diferentes niveles de rigidez en los NCC, se cultivaron células O9-1 de tipo salvaje y se prepararon en hidrogeles para la tinción de inmunofluorescencia (IF) contra la actina filamentosa (F-actina) para mostrar las diferencias en la adhesión celular y las morfologías en respuesta a los cambios en la rigidez del sustrato. Utilizando este sistema in vitro, los investigadores podrán estudiar las funciones de la señalización mecánica en los NCC y su interacción con otras señales químicas para obtener una comprensión más profunda de la relación entre los NCC y la señalización mecánica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo del estudio actual es proporcionar un sistema in vitro eficaz y eficiente para comprender mejor el impacto de las señales mecánicas en los NCC. Además de seguir el protocolo paso a paso mencionado anteriormente, los investigadores deben tener en cuenta que el cultivo celular de NCC O9-1 se ve afectado por el tipo de cubiertas de vidrio utilizadas para preparar hidrogeles. Por ejemplo, se observó que las células sembradas en un tipo específico de cubierta de vidrio (ver la Tabla de Mater…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Ana-Maria Zaske, operadora de las instalaciones de Atomic Force Microscope-UT Core en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, por la experiencia aportada en AFM en este proyecto. También agradecemos a las fuentes de financiamiento de los Institutos Nacionales de Salud (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 y R01HL142704 a J. Wang).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
Riferimenti
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