Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

Summary

Protocolli dettagliati passo-passo sono descritti qui per studiare i segnali meccanici in vitro utilizzando cellule multipotenti della cresta neurale O9-1 e idrogel di poliacrilammide di varia rigidità.

Abstract

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule multipotenti embrionali vertebrate che possono migrare e differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule che danno origine a vari organi e tessuti. La rigidità dei tessuti produce forza meccanica, un segnale fisico che svolge un ruolo fondamentale nella differenziazione NCC; tuttavia, il meccanismo rimane poco chiaro. Il metodo qui descritto fornisce informazioni dettagliate per la generazione ottimizzata di idrogel di poliacrilammide di varia rigidità, la misurazione accurata di tale rigidità e la valutazione dell'impatto dei segnali meccanici nelle celle O9-1, una linea NCC che imita gli NCC in vivo.

La rigidità dell'idrogel è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) e ha indicato diversi livelli di rigidità di conseguenza. Gli NCC O9-1 coltivati su idrogel di varia rigidità hanno mostrato una diversa morfologia cellulare e l'espressione genica delle fibre da stress, che indicavano diversi effetti biologici causati da cambiamenti meccanici del segnale. Inoltre, questo ha stabilito che la variazione della rigidità dell'idrogel ha portato a un efficiente sistema in vitro per manipolare la segnalazione meccanica alterando la rigidità del gel e analizzando la regolazione molecolare e genetica negli NCC. Gli NCC O9-1 possono differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule sotto l'influenza dei corrispondenti mezzi di differenziazione ed è conveniente manipolare i segnali chimici in vitro. Pertanto, questo sistema in vitro è un potente strumento per studiare il ruolo della segnalazione meccanica nelle NCC e la sua interazione con i segnali chimici, che aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo e delle malattie della cresta neurale.

Introduction

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono un gruppo di cellule staminali durante l'embriogenesi dei vertebrati con una notevole capacità di migrare e contribuire allo sviluppo di vari organi e tessuti. Le NCC possono differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui neuroni sensoriali, cartilagine, ossa, melanociti e cellule muscolari lisce, a seconda della posizione di origine assiale e della guida ambientale locale dell'NCC^1,2. Con la capacità di differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule, le anomalie genetiche che causano la disregolazione in qualsiasi fase dello sviluppo della cresta neurale (N....

Protocol

1. Preparazione dell'idrogel

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare che è stata disinfettata con etanolo e ultravioletto (UV) sterilizzato prima dell'uso per mantenere la sterilità. Gli strumenti, come pinzette e pipette, devono essere spruzzati con etanolo. Anche le soluzioni tampone devono essere filtrate sterili.

1. Preparazione di coperture in vetro rivestite di aminosilano
   1. Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio.
      NOTA: preparare altri 3-4 coverslip per garantire forniture di backup sufficienti quando si rompono facilmente. ....

Results

Preparazione dell'idrogel e valutazione della rigidità tramite AFM e modello Hertz
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per generare idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile regolando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide. Tuttavia, gli idrogel di poliacrilammide non sono pronti per l'adesione delle cellule a causa della mancanza di proteine ECM. Pertanto, il sulfo-SANPAH, agendo come un linker, si lega covalentemente agli idrogel e reagisce con le ammine primarie delle protein.......

Discussion

L'obiettivo del presente studio è quello di fornire un sistema in vitro efficace ed efficiente per comprendere meglio l'impatto dei segnali meccanici negli NCC. Oltre a seguire il protocollo passo-passo sopra menzionato, i ricercatori devono tenere presente che la coltura cellulare di NCC O9-1 è influenzata dal tipo di coverslip di vetro utilizzati per preparare gli idrogel. Ad esempio, è stato notato che le cellule seminate su un tipo specifico di coverslip di vetro (vedi la Tabella dei materiali)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm #1 Corning 0211 Vetrino coprioggetti	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-012
2% Bis-acrilammide	Sigma Aldrich	M1533
Piastra a 24 pozzetti	Greiner Bio-one	662165
25 mm #1 Corning 0211 Vetrino coprioggetti	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-025
3-aminopropil trietossisilano (APTS)	Sigma Aldrich	A3648
Piastra per colture cellulari a 4 pozzetti	Thermo Scientific	179830
4% Paraformaldeide	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% Acrilammide	Sigma Aldrich	A4058
50% glutaraldeide	Sigma Aldrich	G7651
Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti	Greiner Bio-one	657160
AFM cantilever (tallone sferico)	Novascan
AFM	Catalizzatore NanoScope		Modello: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Falloidina	Thermo Fisher	A12379
Persolfato di ammonio (APS)	Sigma Aldrich 248614		Polvere
anti-AP-2 e alfa; Anticorpo	Santa Cruz	sc-12726
anticorpo anti-Vinculina	Abcam	ab129002
Microscopia a forza atomica (AFM) Bioscope Catalyst	Bruker Corporation
Collagene di tipo I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)	Thermo Fisher	D1306
Diclorometilsilano (DCMS)		Sigma Aldrich
	Sigma	Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Siero fetale bovino (FBS)	Corning	35-010-CV
Microscopio a fluorescenza	Leica		Modello DMi8
Montaggio Fluoromount-G medio	SouthernBiotech	0100-35
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Polvere
Siero di cavallo	Corning	35-030-CI
iScript Trascrizione inversa Supermix	Bio-Rad	1708841
Penicillina-Streptomicina antibiotico	Thermo Fisher	15140148
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
Sterile 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Acqua deionizzata sterile	Hardy Diagnostics	U284
sulfo-SANPAH	Thermo Fisher	22589
SYBR green	Applied Biosystems	4472908
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416