Ett optimerat O9-1/Hydrogel-system för att studera mekaniska signaler i neurala vapenceller
Summary
Detaljerade steg-för-steg protokoll beskrivs här för att studera mekaniska signaler in vitro med hjälp av multipotenta O9-1 neurala vapenceller och polyakrylamid hydrogeler av varierande styvhet.
Abstract
Neurala vapenceller (NCCs) är ryggradsdjur embryonala multipotenta celler som kan migrera och differentiera sig till ett brett spektrum av celltyper som ger upphov till olika organ och vävnader. Vävnadsstelhet ger mekanisk kraft, en fysisk signal som spelar en avgörande roll i NCC-differentiering; Mekanismen är dock fortfarande oklar. Metoden som beskrivs här ger detaljerad information för optimerad generering av polyakrylamidhydrogeler med varierande styvhet, noggrann mätning av sådan styvhet och utvärdering av effekten av mekaniska signaler i O9-1-celler, en NCC-linje som efterliknar in vivo NCCs.
Hydrogel styvhet mättes med hjälp av atomkraft mikroskopi (AFM) och anges olika styvhet nivåer i enlighet därmed. O9-1 NCCs odlade på hydrogeler av varierande styvhet visade olika cell morfologi och gen uttryck av stress fibrer, som anges varierande biologiska effekter orsakas av mekaniska signal förändringar. Dessutom fastställde detta att varierad hydrogelstyvhet resulterade i ett effektivt in vitro-system för att manipulera mekanisk signalering genom att ändra gelstyvhet och analysera den molekylära och genetiska regleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan differentieras till ett brett spektrum av celltyper under påverkan av motsvarande differentieringsmedium, och det är bekvämt att manipulera kemiska signaler in vitro. Därför är detta in vitro-system ett kraftfullt verktyg för att studera den mekaniska signaleringens roll i NCCs och dess interaktion med kemiska signaler, vilket hjälper forskare att bättre förstå de molekylära och genetiska mekanismerna för neural vapenutveckling och sjukdomar.
Introduction
Neurala vapenceller (NCCs) är en grupp stamceller under ryggradsdjur embryogenes med en anmärkningsvärd förmåga att migrera och bidra till utvecklingen av olika organ och vävnader. NCCs kan skilja sig åt i olika celltyper, inklusive sensoriska nervceller, brosk, ben, melanocyter och släta muskelceller, beroende på platsen för axiellt ursprung och den lokala miljövägledningen för NCC1,2. Med förmågan att differentiera sig till ett brett spektrum av celltyper kan genetiska avvikelser som orsakar dysregulation i något skede av neural crest (NC) utveckling leda till många medfödda sjukdomar2. Till exempel leder störningar under bildandet, migrationen och utvecklingen av nccs till utvecklingsstörningar som kollektivt kallas neurokristopater1,3. Dessa sjukdomar sträcker sig från kraniofacial defekter på grund av misslyckande i NCC-bildandet, såsom Treacher Collins syndrom, till utvecklingen av olika cancerformer på grund av NCC metastaserad migrationsförmåga, som ses i melanom3,4,5,6. Under de senaste decennierna har forskare gjort anmärkningsvärda upptäckter om nccs roller och mekanismer i utveckling och sjukdomar, med de flesta resultaten fokuserade på kemiska signaler7,8. På senare tid har mekaniska signaler indikerats spela en kritisk men dåligt förstådd roll i NCC-utveckling9,10.
De nationella centralbankernas miljösignaler spelar en avgörande roll under deras utveckling, inklusive regleringen av NCC-differentiering i olika celltyper. Miljösignaler, t.ex. fysiska signaler, påverkar pivotala beteenden och cellulära svar, såsom funktionell diversifiering. Mekanotransduktion gör det möjligt för celler att känna av och svara på dessa signaler för att upprätthålla olika biologiska processer2. NCCs är omgivna av närliggande celler och olika substrat, såsom den extracellulära matrisen (ECM), som kan ge upphov till mekaniska stimuli för att upprätthålla homeostas och anpassa sig till förändringarna genom ödesbestämning, spridning och apoptos11. Mekanotransduktion börjar vid plasmamembranet där den sensoriska komponenten i mekaniska extracellulära stimuli uppstår, vilket resulterar i intracellulär reglering av cellen12. Integriner, fokala vidhäftningar och korsningar av plasmamembranrelä mekaniska signaler, såsom skjuvningskrafter, stress och styvheten hos omgivande substrat, till kemiska signaler för att producera cellulära svar12. Reläing av kemiska signaler från plasmamembranet till den slutliga cellregleringen utförs via olika signalvägar för att slutföra vitala processer för organismen, såsom differentiering.
Flera studier har föreslagit att mekanisk signalering från substratstelhet spelar en roll i celldifferentiering13,14. Till exempel har tidigare studier visat att mesenkymala stamceller (MSCs) odlade på mjuka substrat med en styvhet som liknar den hos hjärnvävnad (i intervallet 0,1-1,0 kPa) resulterade i neuronal celldifferentiering15,16. Emellertid, mer MSCs differentieras i myocyt-liknande celler när odlade på 8-17 kPa substrat som efterliknar styvheten i muskeln, medan osteoblast-liknande differentiering observerades när MSCs odlades på styva substrat (25-40 kPa)15,16. Betydelsen av mekanotransduktion belyses av oegentligheter och avvikelser i den mekaniska signalvägen som potentiellt leder till allvarliga utvecklingsdefekter och sjukdomar, inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdomar och osteoporos17,18,19. Vid cancer är normal bröstvävnad mjuk, och risken för bröstcancer ökar i stel och tät bröstvävnad, en miljö som mer liknar brösttumörer15. Med denna kunskap kan effekterna av mekanisk signalering på NCC-utveckling studeras genom enkel manipulering av substratstelhet genom ett in vitro-system, vilket ger ytterligare fördelar och möjligheter att förstå grunderna i NC-relaterad sjukdomsprogression och etiologi.
För att studera effekten av mekaniska signaler i nccs etablerade vi ett effektivt in vitro-system för nccs baserat på optimering av tidigare publicerade metoder och utvärdering av nccs svar på olika mekaniska signaler20,21. Ett detaljerat protokoll tillhandahölls för varierande hydrogel styvhet förberedelse och utvärdering av effekterna av mekanisk signalering i NCCs. För att uppnå detta används O9-1 NCCs som NC-modell för att studera effekterna och förändringarna som svar på styva kontra mjuka hydrogeler. O9-1 NCCs är en stabil NC-cellinje isolerad från musembryon (E) dag 8.5. O9-1 NCCs efterliknar nccs in vivo eftersom de kan skilja sig åt i olika NC-härledda celltyper i definierade differentieringsmedier22. För att studera den mekaniska signalningen av nccs tillverkades ett matrissubstrat med tunable elasticitet från varierande koncentrationer av akrylamid och bis-akrylamidlösningar för att uppnå önskad styvhet, korrelera till den biologiska substratstyvheten20,21,23. För att optimera villkoren för matrissubstrat för NCCs, särskilt O9-1 celler, gjordes ändringar från det tidigare publicerade protokollet20. En förändring som gjordes i detta protokoll var att inkubera hydrogeler i kollagen I, utspädd i 0,2% ättiksyra istället för 50 mM HEPES, vid 37 °C över natten. Det låga pH-värdet av ättiksyra leder till en homogen fördelning och högre kollagen I-inkorporering, vilket möjliggör en mer enhetlig fastsättning av ECM-proteinet24. Dessutom användes en kombination av hästserum och fetala bovin serum (FBS) i koncentrationerna av 10% respektive 5% i fosfatbuffert saltlösning (PBS), innan hydrogelerna i inkubatorn förvarades. Hästserum användes som ett extra komplement till FBS på grund av dess förmåga att främja cellproliferation och differentiering vid koncentrationen av 10%25.
Med denna metod efterliknades en biologisk miljö av ECM-proteinbeläggningen (t.ex. kollagen I) för att skapa en exakt in vitro-miljö för nccs att växa och överleva20,21. Styvheten hos de beredda hydrogelerna analyserades kvantitativt via atomkraftmikroskopi (AFM), en välkänd teknik för att skildra den elastiska modulus26. För att studera effekten av olika styvhetsnivåer på NCCs odlades och framställdes vilda O9-1-celler på hydrogeler för immunofluorescens (IF) färgning mot filamentös aktin (F-aktin) för att visa skillnaderna i cell vidhäftning och morfologier som svar på förändringar i substrate styvhet. Med hjälp av detta in vitro-system kommer forskare att kunna studera rollerna för mekanisk signalering i NCC och dess interaktion med andra kemiska signaler för att få en djupare förståelse för förhållandet mellan NCCs och mekanisk signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med den aktuella studien är att tillhandahålla ett effektivt och effektivt in vitro-system för att bättre förstå effekten av mekaniska signaler i nccs. Förutom att följa det steg-för-steg-protokoll som nämns ovan måste forskare komma ihåg att cellkulturen hos O9-1 NCCs påverkas av den typ av glastäcke som används för att förbereda hydrogeler. Det noterades till exempel att celler som såtts på en viss typ av glastäcke (se tabellen över material) överlevde och spred si…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Ana-Maria Zaske, operatör av Atomic Force Microscope-UT Core-anläggningen vid University of Texas Health Sciences Center, för den bidrog expertisen inom AFM i detta projekt. Vi tackar också finansieringskällorna från National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 och R01HL142704 till J. Wang).
Materials
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
Riferimenti
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Biologia dello sviluppo. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze’ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
- Gavara, N. A beginner’s guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).
